Optimisation de la production d'antivenin de scorpion recombinant par voie biotechnologique : étude de la température d'induction et modélisation de la biocinétique des souches d'E. coli.

Production optimization of recombinant scorpion antivenom through biotechnological pathway : study of temperature of induction and modeling of biokinetics on E. coli strains.

• Auteur / Autrice : Susana Maria Alonso villela
• Direction : Luc Fillaudeau, Cesar Arturo Aceves Lara
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Ingénieries microbienne et enzymatique
• Date : Soutenance le 19/06/2020
• Etablissement(s) : Toulouse, INSA
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences écologiques, vétérinaires, agronomiques et bioingénieries (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : TBI - Toulouse Biotechnology Institute, Bio & Chemical Engineering - Toulouse Biotechnology Institute / TBI
• Jury : Président / Présidente : Balkiss Bouhaouala
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Luc Fillaudeau, Cesar Arturo Aceves Lara, Alain Vande Wouwer, Catherine Béal, Jean-Roch Mouret
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Alain Vande Wouwer, Catherine Béal

Mots clés

Mots clés contrôlés

Escherichia coli

Protéines recombinées

Mots clés libres

Protéines recombinantes

Voie biotechnologique

Escherichia coli

Industrialisation

Recombinant protein

Biotechnological pathway

Escherichia coli

Industrialization

Résumé

Le scorpionisme est un grave problème de santé publique dans les zones tropicales. Il existe environ 12 espèces de scorpions qui sont dangereuses pour l'homme et qui appartiennent toutes à la famille des Buthidae. La sérothérapie utilise des anticorps ou des fragments d'anticorps pour cibler les neurotoxines du venin de scorpion. Les nanobodies, des anticorps dérivés de camélidés, sont plus efficaces que les fragments d'anticorps classiques en raison de leur faible poids moléculaire (15kDa). Le Laboratoire des Venins et Molécules Thérapeutiques de l'Institut Pasteur de Tunis (Tunisie) a produit les nanobody bispécifiques contre les neurotoxines du scorpion Androctonus australis hector.Dans ce projet de doctorat, la production des nanobody bispécifiques NbF12-10 et CH10-12 comme protéines recombinantes chez Escherichia coli a été étudiée. Deux clones de la souche NbF12-10 ont été utilisés (NN et NO), et la souche E. coli WK6 a été utilisée comme référence. Les quatre souches ont été caractérisées en milieu riche (terrific broth, TB) et ont défini un milieu minimal (MM) dans des cultures en flacons agités. Dans le TB, toutes les souches croissent à une moyenne de µ=0.4h-1. Les souches WK6 et CH10-12 avaient un µmax=0.6h-1 en MM. Le clone NbF12-10 NO ne pouvait pas se cultiver en MM, et le clone NbF12-10 NN avait un µmax=0.2h-1 en MM. Le rendement YX/S était de 0.4g/g en MM pour toutes les souches et le rendement d'acétate sur glucose était compris entre 0.06 et 0.14g/g. L'extraction périplasmique des nanobody NbF12-10 et CH10-12 a été testée dans TB, une amélioration de 300% de la libération des protéines périplasmiques a été obtenue, par rapport aux méthodes conventionnelles. La souche CH10-12 a produit 20 fois plus des nanobody que la souche NbF12-10 NN (1.58 contre 0.08mg/L). La quantification du nanobody a été réalisée grâce à un protocole de densitométrie développé au cours de cette thèse. Le protocole utilise un programme de traitement d'images (ImageJ) pour quantifier les profils de densité optique des gels d'électrophorèse. Cela a fait l'objet d'un article publié dans MicrobiologyOpen (Wiley).La production des nanobody CH10-12 et NbF12-10 a été testée dans des cultures en bioréacteur dans des cultures à haute densité cellulaire en MM (>25gcdw/L) par une stratégie spécifique de fed-batch. L'effet de la température (28-37°C) pendant l'expression des protéines et la durée de la phase d'induction (6-38h) ont été étudiés. Les températures les plus basses (28°C, 30°C) ont produit le titre le plus élevé de nanobody CH10-12 (2.3mg/L) après 10h et 12h d'induction, respectivement. Dans les cultures à haute température (33°C, 37°C), la production du nanobody était plus faible (0.4, 0.2 mg/L). Dans les cultures où la phase d'induction était plus longue (>30h), la production du nanobody CH10-12 a été entravée et a atteint un plateau après 10h (32°C, 0.7 mg/L) à 25h (29°C, 1.4mg/L). Le nanobody NbF12-10 a également atteint un plateau après 10h d'induction (0.7mg/L). La charge métabolique a été réduite en diminuant la température d'induction, permettant la production de titres plus élevés de nanobody. Un métabolisme de maintenance élevé a été constaté pendant la phase d'induction, et la consommation de citrate pourrait laisser supposer une composition inadéquate du milieu de culture pour la phase d'induction. Deux protéines non spécifiques ont été trouvées dans les échantillons de nanobody purifiés: une protéine de faible poids moléculaire (11kDa), produit de dégradation du nanobody causé par une température élevée, et une protéine de poids moléculaire élevé (84kDa), agrégat de protéines produit en réponse à une composition inadéquate du milieu et au faible taux de croissance spécifique. La génération de protéines inconnues dans les échantillons purifiés de nanonody pourrait être une réponse de la souche au faible taux de croissance spécifique et à la longue durée d'exposition à l'inducteur.

Scorpionism is a serious public health problem in tropical areas, especially in Africa, southern India, the Middle East, and Latin America. There are about 12 species of scorpions that are dangerous to humans and all belong to the Buthidae family. In particular, venom on scorpion Androctonus australis hector is particularly toxic to humans. Serotherapy uses antibodies or fragments of antibodies to target the neurotoxins of the scorpion venom. Nanobodies, camelid-derived antibodies, are more effective than the conventional fragments of antibodies due to their low molecular weight (15 kDa). The Laboratoire des Venins et Molécules Thérapeutiques of the Pasteur Institute of Tunis (LVMT-IPT, Tunis, Tunisia) has produced the bispecific nanobodies against the neurotoxins of the Androctonus australis hector scorpion.In this doctoral project, the production of the bispecific nanobodies NbF12-10 and CH10-12 as recombinant proteins in Escherichia coli was studied. Two clones of the NbF12-10 strain were used (NN and NO), and strain E. coli WK6 was used as reference. The four strains were characterized in rich medium (TB) and defined minimal medium (MM) in shake-flask cultures. In TB, all strains grow at an average µ=0.4h-1. The strains WK6 and CH10-12 had a µmax=0.6h-1 in MM. The clone NbF12-10 NO could not grow in MM, and the clone NbF12-10 NN had a µmax=0.2h-1 in MM. The yield YX/S was 0.4g/g in MM for all strains and the yield of acetate on glucose was between 0.06 and 0.14g/g. The periplasmic extraction of the nanobodies NbF12-10 and CH10-12 was tested in TB, an improvement of 300% in the release of periplasmic proteins was achieved, compared to conventional methods. The strain CH10-12 produced 20-fold higher nanobody than the strain NbF12-10 NN (1.58 vs 0.08mg/L). The quantification of the nanobody was made through a densitometry protocol developed during this thesis. The protocol uses a processing image program (ImageJ) to quantify the optical density profiles of electrophoresis gels. The band of 50kDa of the molecular weight marker was used as reference for 750ng of recombinant protein. This was the subject of an article published in MicrobiologyOpen (Wiley).The production of the nanobodies CH10-12 and NbF12-10 were tested in bioreactor cultures in high cell density cultures in MM (>25gcdw/L) through a specific fed-batch strategy. The effect of the temperature (28–37°C) during protein expression and the duration of the induction phase (6–38h) were studied. The lower temperatures (28°C, 30°C) produced the highest titer of nanobody CH10-12 (2.3mg/L) after 10h and 12h of induction, respectively. In high temperature cultures (33°C, 37°C) the production of the nanobody was lower (0.4, 0.2mg/L). In cultures where the induction phase was longer (>30h), the production of the nanobody CH10-12 was hampered and reached a plateau after 10h (32°C, 0.7mg/L) to 25h (29°C, 1.4mg/L). The nanobody NbF12-10 also reached a plateau after 10h of induction (0.7mg/L). The metabolic burden was lowered by decreasing the temperature of induction, allowing the production of higher titers of recombinant nanobody. The effect of the low specific growth rate (0.02h-1) and the long exposure to the inducer (IPTG, >30h) could have produced a stringent response in the strain. High maintenance metabolism was found during the induction phase, and the consumption of citrate could hint an inadequate composition of the culture medium for the induction phase. Two non-specific proteins were found in the purified nanobody samples: a low molecular weight (11kDa), degradation product of the nanobody caused by a high temperature, and a high molecular weight protein (84kDa), protein aggregate produced as a response to an inadequate medium composition and the low specific growth rate. The generation of unknown proteins in the purified samples of nanobody could be a response of the strain to the low specific growth rate and the long exposure time to the inducer.