Microscopie à trois photons : instrumentation et extension des paramètres observables

par Júlia Ferrer ortas

Thèse de doctorat en Physique

Sous la direction de Emmanuel Beaurepaire et de Willy Supatto.

Thèses en préparation à l'Institut polytechnique de Paris , dans le cadre de École doctorale de l'Institut polytechnique de Paris , en partenariat avec LOB - Laboratoire d'Optique et Biosciences (laboratoire) .


  • Résumé

    La microscopie multiphotonique est la technique de référence pour l'imagerie de fluorescence des tissus intacts. Il a récemment été démontré que la microscopie à trois photons (3P) offre un contraste supérieur à l'imagerie à deux photons (2P) à grande profondeur dans les milieux diffusants densément marqués. Cet avantage est dû au meilleur confinement de l'excitation 3P et à la diffusion réduite aux longueurs d'onde utilisées. Bien que cette approche prometteuse ait permis d'atteindre des profondeurs d'imagerie supérieures au millimètre dans le cerveau de souris, elle n'est pas encore complètement stabilisée technologiquement, et manque de modalités d'imagerie multicolore. Dans ce travail, nous explorons l'extension du nombre de signaux et de paramètres qui peuvent être utilisés en microscopie 3P des tissus profonds. Dans un premier chapitre, nous introduisons les concepts impliqués dans la microscopie 3P et nous analysons les paramètres limitant la profonde ur d'imagerie. Dans un second chapitre, nous décrivons la construction et l'optimisation d'un microscope 3P utilisant une nouvelle génération d'amplificateurs paramétriques optiques (OPA) multifaisceaux adaptés à l'excitation 3P dans la gamme proche infrarouge. Nous discutons notamment les questions liées à la stabilité de la source, la compensation de la dispersion et la combinaison des faisceaux dans le microscope. Dans les deux derniers chapitres, nous présentons les résultats de deux projets visant à étendre les signaux utilisables dans un système 3P. Dans le troisième chapitre, nous explorons l'efficacité de l'excitation 3P à 1030 nm de plusieurs protéines fluorescentes (FPs) bleues, afin de compléter les études précédentes rapportant l'excitation 3P des FPs vertes et rouges, respectivement à 1300 et 1700 nm. Nous identifions des FPs bleues présentant une efficacité d'excitation et produisant un niveau de signal comparable aux protéines vertes et rouges. Ces résultats encouragea nts ouvrent des perspectives pour la microscopie 3P en couleur. Dans le quatrième chapitre, nous explorons la possibilité d'une imagerie cohérente multicolore basée sur la génération de somme de fréquences de troisième ordre. Nous montrons que cette nouvelle modalité de contraste sans marquage révèle les vaisseaux sanguins avec une possibilité d'imagerie fonctionnelle, et qu'elle peut être directement intégrée sur un microscope 3P. Globalement, le travail décrit dans cette thèse étend le nombre de signaux qui peuvent être sondés en microscopie en profondeur des tissus diffusants.

  • Titre traduit

    Three-photon microscopy: instrumentation and extension of the observable parameters


  • Résumé

    Multiphoton microscopy is the reference technique for fluorescence imaging of intact tissues. Three-photon (3P) microscopy was recently demonstrated as providing superior contrast than two-photon (2P) imaging at large depths in densely labelled scattering media. This advantage is due to the superior confinement of the 3P excitation and the reduced scattering experienced at longer wavelengths. Although this promising approach has made it possible to reach imaging depths beyond one millimetre in the mouse brain, it is not yet fully mature technologically and lacks efficient multicolor imaging modalities. In this work, we explore the extension of the number of signals and parameters that can be used in deep-tissue 3P microscopy. In a first chapter, we introduce the concepts underlying 3P microscopy and we analyse the parameters limiting imaging depth. In a second chapter, we describe the construction and optimization of a 3P microscope based on a new generation of multibeam optical parametric amplifier (OPA) source adapted for 3P excitation in the short-wavelength infrared range. We pay particular attention to source stability, dispersion compensation, and beam combination in the microscope. In the two remaining chapters, we present the results of two projects aiming at extending the signals usable in a 3P system. In the third chapter, we explore the 3P excitation efficiency of several blue fluorescent proteins (FPs) with 1030 nm light, in order to complement previous studies reporting 3P excitation of green and red FPs at 1300 and 1700 nm, respectively. We identify efficiently excited blue FPs producing signal levels comparable to green and red proteins. These encouraging results open perspectives for multicolor 3P microscopy. In the fourth chapter, we explore the possibility of multicolor coherent imaging based on third-order sum-frequency generation. We show that this new contrast modality provides label-free contrast highlighting blood vessels with a possibility of functional imaging, and that it can be directly integrated on a 3P microscope. Overall, the work described in this thesis extends the number of signals that can be probed in deep-tissue microscopy.