Bases moléculaires du syndrome de Waardenburg : focus sur SOX10 et un gène candidat

Molecular bases of Waardenburg syndrome : focus on SOX10 and a candidate gene

• Auteur / Autrice : William Bertani Torres
• Direction : Véronique Pingault, Nadège Bondurand
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Génétique
• Date : Soutenance le 19/12/2023
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut des Maladies Génétiques (Paris)
• Jury : Président / Présidente : Patrick Vourc'h
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Raphaël Etournay
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Irina Ioana Giurgea, Benoît Arveiler

Mots clés

Mots clés contrôlés

Maladies

Troubles de la perception auditive

Crête neurale

Syndromes de Waardenburg

Mots clés libres

Syndrome de Waardenburg

Crête neurale

Perte auditive

Maladie génétique rare

Identification des gènes

Waardenburg syndrome

Neural crest

Hearing loss

Rare genetic disease

Gene identification

Résumé

Le syndrome de Waardenburg (SW) est une maladie rare caractérisée par une surdité et des altérations pigmentaires des cheveux, de l'iris et de la peau, dues à un défaut du développement de la crête neurale (CN). Ce syndrome est divisé en quatre types sur la base du phénotype. Bien que le plus simple d'un point de vue clinique, le SW de type 2 (SW2) est le moins bien compris, avec seulement la moitié des cas expliqués au niveau moléculaire. Dans le but d'identifier de nouveaux gènes, nous avons procédé au séquençage de l'exome entier d'une cohorte de 16 patients atteints de WS2 sans explication moléculaire. J'ai ainsi trouvé 3 patients porteurs de variants hétérozygotes, rares et prédits pathogènes dans ADAMTS20, un gène codant une enzyme qui clive le versican (VCAN) au niveau de la matrice extracellulaire et impliquée dans le développement des mélanocytes. Le séquençage ciblé d'ADAMTS20 chez 8 autres patients nous a ensuite permis d'identifier un quatrième variant dans ce gène. Une analyse familiale approfondie de ces cas d'ADAMTS20 a montré une coségrégation du variant et de la maladie dans deux familles (hérédité dominante) et une interprétation qui semblait plus complexe en première approche dans les deux autres. Afin d'éliminer les réarrangements génomiques et les variants non codants autour des gènes WS connus, un séquençage du génome entier en trios a été réalisé pour ces 4 cas et pour 4 autres cas pour lesquels aucun gène candidat n'avait été identifié. C'est ainsi que j'ai identifié et publié un réarrangement de novo de SOX10 en mosaïque chez l'un des patients, qui explique très probablement le phénotype. Ce patient portait un variant d'ADAMTS20 mais l'étude de ségrégation ne semblait pas cohérente avec l'histoire familiale. J'ai ensuite réalisé des tests fonctionnels pour évaluer la perte de fonction des trois variants d'ADAMTS20 restants. En utilisant plusieurs modèles cellulaires (hTERT RPE-1 ; NIH-3T3 ; HEK 293T ; B16-F10), j'ai analysé l'expression et la localisation subcellulare d'ADAMTS20 ainsi que les modifications de la forme cellulaire et nucléaire. Parallèlement, j'ai testé par western blot le clivage du VCAN, la cible principale de l'enzyme ADAMTS20. Pour évaluer les variantes d'ADAMTS20 dans un modèle in vivo, je me suis concentré sur la souris et le xénope. Nous avons caractérisé la dépigmentation et la capacité auditive du modèle murin Adamts20 (belted) avec la mutation homozygote p.Gln665*. En collaboration avec le Dr. Grant Wheeler, nous avons réalisé un knock-out CRISPR-cas9 du gène pour observer le phénotype résultant et injecté de l'ARNm contenant soit la forme sauvage soit les variants d'Adamts20, afin d'analyser le sauvetage phénotypique du knock-out. Un deuxième objectif de mon travail était d'utiliser des protocoles de différenciation CN de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) pour mettre en place une analyse fonctionnelle des mutations de SOX10, avec une application future possible à de nouveaux gènes de WS. Trois lignées iPSC provenant de patients porteurs de mutations SOX10 ont été générées. Le potentiel de différenciation cellulaire à différents moments a été analysé par RTqPCR et immunocytochimie, ouvrant la voie à de futures études de corrélation génotype-phénotype. Dans l'ensemble, mon projet de doctorat a permis d'identifier et d'étudier un gène candidat et une voie de développement qui peuvent être liés à des cas non résolus de WS2, et aidera à transférer les connaissances aux familles par le biais du conseil génétique.

Waardenburg syndrome (WS) is a rare disease characterized by hearing loss and pigmentary alterations in hair, iris and skin, due to defects of neural crest (NC) development. This syndrome is divided in 4 types based on differential phenotype. Although the simplest on a clinical point of view, type 2 WS (WS2) is the least understood one, with only half the cases explained at the molecular level. With the aim to identify novel gene(s), we performed whole exome sequencing in a cohort of 16 molecularly undiagnosed WS2 patients. I thus found 3 patients carrying heterozygous, rare, predicted pathogenic variants in ADAMTS20, coding for an enzyme that cleaves versican (VCAN) at the extracellular matrix and is involved in the development of melanocytes. Targeted ADAMTS20 sequencing in 8 additional patients subsequently led us to identify a 4th ADAMTS20 variant. Extensive familial analysis of these ADAMTS20 cases showed co-segregation of the variant and disease in two families (dominant inheritance) and a segregation that looked more complex at first glance in the other two. To eliminate genomic rearrangements/non-coding variants around the known WS genes, whole genome sequencing in trios was performed for these 4 cases and in 4 other cases with no good candidate gene. This is how I identified and published a de novo SOX10 rearrangement in mosaicism, which is likely to explain the phenotype in one of the patients with an inconsistent segregation of the ADAMTS20 variation. I subsequently performed functional tests to evaluate the loss of function of the three remaining ADAMTS20 variants. Making use of several cellular models (hTERT RPE-1; NIH-3T3; HEK 293T; B16-F10) I analyzed the expression and subcellular location of ADAMTS20 and changes in cellular and nuclear shape. In parallel, I tested the cleavage of VCAN, the main target of the ADAMTS20 enzyme, by western blot. To evaluate the ADAMTS20 variants in an in vivo model, I focused on mice and Xenopus. We characterized the depigmentation and hearing capability of the Adamts20 (belted) mouse with the homozygous p.Gln665* mutation. In collaboration with Dr. Grant Wheeler, we performed CRISPR-cas9 knockout of the gene to observe the generated phenotype and injected mRNA containing either the wild-type or variants Adamts20 in order to analyze phenotypic rescue of the knockout. A second objective of my work was to use human induced pluripotent stem cells (hiPSC) NC differentiation protocols to set up functional analysis of SOX10 mutations, with possible future applications to new WS genes. Three iPSC lines from patients carrying SOX10 mutations were generated. Cell differentiation potential at different time points were analyzed by RTqPCR and immunocytochemistry, paving the way to future genotype-phenotype correlation studies. Overall, my PhD project helped to identify and characterized a candidate gene and pathway that can be related to the unsolved cases of WS2 and will help to transfer the knowledge back to the families through genetic counseling.