Approches d'ingénierie métabolique en levure pour la sécurisation de la production de l'anticancéreux Etoposide en région Centre-Val de Loire

Yeast metabolic engineering approaches to secure the production of the anticancer drug Etoposide in Centre-Val de Loire region

• Auteur / Autrice : Jennifer Perrin
• Direction : Nathalie Guivarc'h, Vincent Courdavault, Sébastien Besseau
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 31/01/2023
• Etablissement(s) : Tours
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant (Centre-Val de Loire ; 2012-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Biomolécules et Biotechnologies Végétales
• Jury : Président / Présidente : Corinne Auge-Gouillou
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Magali Remaud, Ophélie Fliniaux
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Romain Larbat, Nicolas Papon

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéines -- Modifications posttraductionnelles

Bioréacteurs

Cytochromes

CRISPR-Cas9

ARN -- Modifications posttranscriptionnelles

Expression génique

Levures (botanique)

Pharmacocinétique

Podophyllotoxine

Transfert génétique

Ingénierie métabolique

Précurseurs

Étoposide

Mots clés libres

Ingénierie métabolique

Levure

Podophyllotoxine

Bioconversion

Étoposide

Bioréacteur

Metabolic engineering

Yeast

Podophyllotoxin

Bioconversion

Etoposide

Bioreactor

Résumé

L'ETOPOSIDE est un lignane, dérivé de la podophyllotoxine, très couramment employé en chimiothérapie. Actuellement, sa production ne dépend que du sourcing en podophyllotoxine extraite des rhizomes de Podophyllum hexandrum. La pression exercée sur les ressources naturelles qui en découle occasionne des pénuries d'approvisionnement de cette molécule. Dans ce contexte, ces travaux de thèse CIFRE, menés avec le groupe industriel Axyntis, visent à développer une alternative de synthèse par des approches d'ingénierie métabolique via la création de cellules usines de levures productrices d'un précurseur d'ETOPOSIDE. Ils reposent plus spécifiquement sur la création d'une souche de levure capable de bioconvertir la yatéine (YAT, un lignane précurseur de podophyllotoxine) hautement biodisponible chez de nombreuses espèces végétales en (-)-4'-déméthyl-épipodophyllotoxine (4'dEPT) directement utilisable pour la production d'ETOPOSIDE. Pour ce faire, les trois gènes assurant la conversion de YAT en 4'dEPT chez P. hexandrum et codant une dioxygénase et deux cytochromes P450 (CYP71BE54 et CYP82D61) ont été intégrés, via le système CRISPR/Cas9, dans le génome de la souche Saccharomyces cerevisiae CEN-PK713D compatible avec une utilisation industrielle. L'optimisation de l'activité de bioconversion de la souche a été axée sur l'ajustement de la balance des copies de gènes transférés et sur l'amélioration de l'activité catalytique de CYP82D61 décrite pour catalyser l'étape d'hydroxylation terminale de la 4'dEPT à faible rendement. Parmi les stratégies testées, l'utilisation de gènes de synthèse à codons optimisés pour favoriser la traduction en levure et la co-expression d'une cytochrome P450 réductase spécifique de P. hexandrum ont permis une optimisation majeure du flux métabolique permettant la bioconversion de la YAT fournie aux levures en culture en 4'dEPT. En parallèle, un protocole d'extraction et de purification de YAT ​​à partir des parties vertes de plants de Juniperus a été mis en place et est en cours de transfert à échelle industrielle au sein d'Axyntis. A terme, la souche de levure lui sera également transférée pour assurer des cultures en bioréacteurs de grande capacité afin de sécuriser l'approvisionnement en ETOPOSIDE via la relocalisation de production en région Centre Val de Loire. Enfin, une souche productrice de tri-hydroxycinnamoyl spermidines, phénolamides accumulés dans le manteau pollinique, a également été générée et permettra d'étudier plus profondément les fonctions et les applications potentielles de ce type de composés.

ETOPOSIDE is a lignan derived from podophyllotoxin, which is widely used in chemotherapy. Currently, its production only relies on the podophyllotoxin extracted from Podophyllum hexandrum rhizomes. The pressure on natural resources resulting from this supply causes recurrent shortages of this molecule. In this context, this CIFRE PhD thesis, carried out with the industrial group Axyntis, aims at developing an alternative approach of synthesis through metabolic engineering and the creation of yeast factory cells producing an ETOPOSIDE precursor. More specifically, this work is based on the creation of a yeast strain capable of bioconverting yatein (YAT, a lignan precursor of podophyllotoxin) highly bioavailable in many plant species into (-)-4'-desmethyl-epipodophyllotoxin (4'dEPT) directly usable for the ETOPOSIDE production. To his end, the three genes ensuring the conversion of YAT into 4'dEPT in P. hexandrum, encoding a dioxygenase and two cytochromes P450 (CYP71BE54 and CYP82D61) were integrated via the CRISPR/Cas9 system into the genome of the Saccharomyces cerevisiae strain CEN-PK713D compatible with an industrial use. To optimize bioconversion efficiency of this strain, we have mainly focused on adjusting the balance of transferred genes copies and on the improvement of CYP82D61 catalytic activity described to catalyze the terminal hydroxylation step of 4'dEPT with a low yield. Among the tested strategies, the use of codon-optimized synthetic genes to promote translation in yeast and the co-expression of a cytochrome P450 reductase specific to P. hexandrum allowed a major improvement of the metabolic flow thus allowing a very efficient bioconversion of the YAT supplied to the yeast in culture into 4'dEPT. On the other hand, a protocol for the extraction and the purification of YAT from the green parts of Juniperus plants has been implemented and is being transferred to an industrial scale at Axyntis. At midterms, the strain will also be transferred to Axyntis to perform the yeast culture in high capacity bioreactors in order to secure the ETOPOSIDE supply by relocating the production to the Centre-Val de Loire region. Finally, a last yeast strain synthesizing tri-hydroxycinnamoyl spermidines, which correspond to phenolamides compounds accumulated in the pollen coat, was also generated in order to initiate the detailed study of their in planta functions but also their potential industrial applications.