Evaluation d'EZH2, une enzyme de régulation épigénétique comme facteur d'agressivité et cible thérapeutique dans le carcinome à cellules de Merkel

Evaluation of EZH2, an epigenetic regulatory enzyme, as an aggressiveness factor and as therapeutic target in Merkel cell carcinoma.

• Auteur / Autrice : Marie-Alice Durand
• Direction : Antoine Touze
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Sciences de la Vie et de la Santé
• Etablissement(s) : Tours
• Ecole(s) doctorale(s) : Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant - SSBCV
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : ISP - Infectiologie et Santé publique
• Jury : Président / Présidente : Philippe Roingeard
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Antoine Touze, Lise Boussemart, Thibault Kervarrec, Marie-Dominique Galibert, Paul Peixoto, Eve Maubec
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Lise Boussemart, Marie-Dominique Galibert

Mots clés

Mots clés libres

Carcinome à cellules de Merkel

Ezh2

Polyomavirus

Epigénétique

Merkel cell carcinoma

Ezh2

Polyomavirus

Epigenetic

Résumé

Le carcinome à cellules de Merkel (CCM) est un cancer cutané rare et agressif dont la survie à 5 ans est estimée à environ 40%. En 2008, l'intégration génomique du Polyomavirus à cellules de Merkel (MCPyV) et l'expression des deux oncogènes viraux LT et sT, ont été identifiées comme les déterminants oncogéniques de 80% des CCM. Les 20% de CCM restants sont induits par l'exposition aux UV. Au stade métastatique, ce cancer est traité avec des inhibiteurs de points de contrôle immunitaires anti-PDL1 (avelumab). Cependant, une réponse clinique n'est observée que dans environ 50% des cas soulignant l'intérêt de développer de nouveaux traitements. Récemment, l'expression d'EZH2 (Enhancer of zeste homolog 2), une histone méthyltransférase impliquée dans l'agressivité de nombreux cancers solides, a été mise en évidence dans les tumeurs de CCM et son ciblage a été suggéré pour la thérapie. La perte d'expression des molécules du CMH-I à la surface des cellules est un point clé de la résistance aux immunothérapies dans le CCM et serait liée à une dérégulation épigénétique impliquant entre autres EZH2. Dans ce contexte, l'objectif global de notre travail était de caractériser le l'implication d'EZH2 dans le CCM. Tout d'abord, les niveaux d'expression d'EZH2 et de sa marque répressive H3K27me3 ont été évalués par immunohistochimie sur une cohorte de CCM (n=170). L'analyse de cette cohorte a confirmé une expression élevée d'EZH2 dans la plupart des tumeurs (73,3%), associée à des niveaux élevés d'H3K27me3 (p<0,0001), et en particulier dans les tumeurs viro-positives (p=0,0345), suggérant un impact des oncogènes viraux sur l'expression d'EZH2. In vitro, le knockdown des antigènes viraux (shARN) dans des lignées cellulaires de CCM (WaGa, PeTa, MKL-1) conduit à une réduction de l'expression d'EZH2 et, que l'expression ectopique des oncogènes viraux dans des fibroblastes primaires, induisait son expression. Par ailleurs, une perte d'expression d'EZH2 et/ou d'H3K27me3 a été observée dans certains CCM viro-négatifs. L'expression d'EZHIP un modulateur de l'activité d'EZH2, a été identifiée dans une partie d'entre eux. L'impact de l'inhibition pharmacologique d'EZH2 sur la biologie des lignées cellulaires de CCM a ensuite été évalué. Cette inhibition par le tazemetostat et le DZNeP induisait la mort cellulaire sur les lignées virus-positives exprimant EZH2 (WaGa, PeTa, MKL-1). Cette inhibition conduisait également à la réexpression des molécules du CMH-I, évaluée par cytométrie en flux. Ainsi l'utilisation d'inhibiteurs d'EZH2 pourrait ainsi être envisagée en combinaison avec des immunothérapies chez les patients présentant un CCM. Pour conclure, EZH2 est surexprimée dans la majorité des CCM, l'expression de l'antigène LT contribuant à son expression dans les CCM viro-positifs. L'inhibition pharmacologique d'EZH2 par différents inhibiteurs induit la mort cellulaire des lignées de CCM in vitro et pourrait constituer une cible thérapeutique, notamment en association avec des immunothérapies.

Merkel cell carcinoma (MCC) is a rare and aggressive skin cancer with an estimated 5-year survival of approximately 40%. In 2008, the genomic integration of Merkel cell polyomavirus (MCPyV) and the expression of the two viral oncogenes LT and sT were identified as the oncogenic determinants of 80% of MCCs. The remaining 20% of MCCs are induced by UV exposure. MCC metastatic patients are treated with anti-PDL1 immune checkpoint inhibitors (avelumab). However, a clinical response is observed in only about 50% of cases, highlighting the interest in developing new treatments. Recently, the expression of EZH2 (Enhancer of zeste homolog 2), a histone methyltransferase involved in the aggressiveness of many solid cancers, has been demonstrated in MCC tumors and its targeting has been suggested for therapy. The loss of expression of MHC-I molecules on the cell surface is a key point of resistance to immunotherapies in MCC and would be linked to an epigenetic deregulation involving among others EZH2. In this context, the overall objective of our work was to characterize the involvement of EZH2 in MCC. First, the expression levels of EZH2 and its repressive mark H3K27me3 were assessed by immunohistochemistry on a cohort of MCC (n=170). Analysis of this cohort confirmed high EZH2 expression in most tumors (73.3%), associated with high levels of H3K27me3 (p<0.0001), and particularly in viral-positive tumors (p=0.0345), suggesting an impact of viral oncogenes on EZH2 expression. In vitro, knockdown of viral antigens (shRNAs) in MCC cell lines (WaGa, PeTa, MKL-1) led to a reduction of EZH2 expression and ectopic expression of viral oncogenes in primary fibroblasts induced its expression. In addition, loss of EZH2 and/or H3K27me3 expression was observed in some viral-negative MCCs. The expression of EZHIP, a modulator of EZH2 activity, was identified in a part of them. The impact of pharmacological inhibition of EZH2 on the biology of MCC cell lines was then evaluated. This inhibition by tazemetostat and DZNeP induced cell death in virus-positive lines expressing EZH2 (WaGa, PeTa, MKL-1). This inhibition also led to the re-expression of MHC-I molecules, as assessed by flow cytometry. Thus, the use of EZH2 inhibitors could be considered in combination with immunotherapies in patients with MCC. In conclusion, EZH2 is overexpressed in the majority of MCCs, with LT antigen expression contributing to its expression in virus-positive MCCs. Pharmacological inhibition of EZH2 by different inhibitors induces cell death in MCC lines in vitro and could be a therapeutic target, especially in combination with immunotherapies.