Radiorésistance et radiosensibilisation du médulloblastome de haut risque de groupe 3

Radioresistance and radiosensitization in high-risk Group 3 pediatric medulloblastoma

• Auteur / Autrice : Eleanor Hawkins
• Direction : Celio Pouponnot
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Hématologie-oncologie
• Date : Soutenance le 13/12/2023
• Etablissement(s) : Université Paris sciences et lettres
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Hématologie, oncogenèse et biothérapies
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Signalisation, radiobiologie et cancer (Orsay, Essonne ; 2010-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Institut Curie (Paris ; 1978-....)
• Jury : Président / Présidente : Élizabeth Moyal
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Celio Pouponnot, Samuel Meignan, Silvia Marino, Claire Alapetite, Eddy Pasquier, François Radvanyi
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Samuel Meignan, Silvia Marino

Mots clés

Mots clés libres

Radiorésistance

Médulloblastome

Radiothérapie

Radiosensibilisateur

Dna-Pk

Radioresistance

Medulloblastoma

Radiotherapy

Radiosensitizer

Dna-Pk

Résumé

Le médulloblastome (MB) est la tumeur cérébrale maligne la plus fréquente chez l'enfant qui est traitée par un schéma multimodal de résection chirurgicale, de chimiothérapie et de radiothérapie. Le MB est classé en quatre groupes moléculaires, dont le groupe 3 (G3), caractérisé par la surexpression de MYC, qui a le plus mauvais pronostic. Un traitement agressif, dans lequel la radiothérapie est essentielle, permet un taux de survie d'environ 50 %, mais induit des effets secondaires importants. En outre, les rechutes sont fréquentes. La rechute du MB représente ~10% de tous les décès liés au cancer chez les enfants. Mon projet a deux axes principaux: dans le premier, j'ai utilisé des approches ciblées pour valider le peposertib, un inhibiteur de la DNA-PK, en tant que radiosensibilisateur dans la MB de G3, et dans le second, j'ai utilisé des approches non biaisées pour tenter d'élucider les mécanismes par lesquels le MB de G3 échappe à l'irradiation pour aboutir à une rechute.Projet 1: Nous avons identifié DNA-PK comme une cible potentielle pour la radiosensibilisation des cellules tumorales dans le traitement initial de MB de G3 afin de prévenir les rechutes. DNA-PK a été identifiée dans un criblage in vitro, où son inhibition s'est avérée significativement efficace pour radiosensibler les cellules de MB de G3 en comparaison à d'autres composés ciblant les dommages à l'ADN. Une analyse de bases de données publiques a révélé une forte expression de DNA-PK dans les MB de G3, ainsi qu'une forte corrélation avec l'expression de MYC. L'inhibition pharmacologique avec le peposertib, un inhibiteur spécifique de DNA-PK, ou le knockdown (KD) de DNA-PK par shRNA in vitro ont augmenté la radiosensibilité des cellules G3 en induisant l'apoptose. En outre, des analyses mécanistiques ont révélé que l'inhibition pharmacologique de DNA-PK associée à l'irradiation induisait un puissant arrêt du cycle cellulaire en phase G2/M et une augmentation significative des lésions de l'ADN, mesurées par les foyers positifs pour la protéine γH2AX. Les analyses des foyers positifs pour 53BP1 suggèrent que cet effet est dû à une diminution de l'activité de la voie de réparation de l'ADN par NHEJ. L'intérêt d'une combinaison de l'inhibition de DNA-PK avec l'irradiation a été validé in vivo sur des souris greffées en orthotopique avec des lignées de G3 et des modèles très pertinents de PDX de MB de G3 (xénogreffes dérivées de patients). Cette combinaison n'a pas montré de toxicité majeure (tests de poids et sanguins) dans les modèles murins pédiatriques. Dans l'ensemble, nos résultats identifient le peposertib comme un radiosensibilisant dans le traitement de MB à haut risque de G3. [Le peposertib a été fourni par Merck (CrossRef Funder ID: 10.13039/100009945)].Projet 2 : Dans ce projet, nous avons généré des modèles murins in vivo de MB par greffe orthotopique qui récapitulent le processus de rechute observée chez les patients après thérapie. Ainsi, après une croissance initiale, les tumeurs sont irradiées en fractionné ce qui conduit à une diminution du volume tumoral correspondant à la maladie résiduelle suivie par une reprise de la croissance tumorale et à une rechute. Nous avons utilisé ces modèles pour effectuer des analyses de séquençage d'ARN (RNAseq) par "bulk" et sur cellules uniques ainsi que de "phosphoarray" sur des tumeurs avant irradiation, immédiatement après irradiation, au moment de la maladie résiduelle et après reprise de croissance/rechute. Nous avons également réalisé un criblage CRISPR-Cas9 in vitro, afin d'identifier les gènes qui permettent aux cellules MB de G3 de survivre à l'irradiation. Les résultats obtenus ont révélé une reprogrammation significative des tumeurs après l'irradiation.Globalement, l'objectif de ces travaux était de mieux comprendre la manière dont les cellules de MB de G3 répondent à l'irradiation, afin d'identifier de nouveaux mécanismes et cibles thérapeutiques dans le but de diminuer le taux de rechute.

Medulloblastoma (MB) is the most common pediatric malignant brain tumour, and is treated with a multimodal regimen of surgical resection, chemotherapy, and radiotherapy. Transcriptomic analysis has allowed the categorization of these tumours into four molecular subtypes, of which Group 3 (G3), characterized by MYC overexpression, has the worst prognosis. Aggressive treatment, in which radiotherapy is essential, allows a ~50% survival rate, but induces strong side effects. Further, relapse is common and almost always fatal, with relapsed MB accounting for ~10% of all cancer-related deaths in children. My project had two primary branches: in the first I used targeted approaches to validate peposertib, an inhibitor of DNA-PK, as an effective radiosensitizer in G3 MB; and in the second, I used unbiased approaches to attempt to elucidate the mechanisms by which G3 MB escapes irradiation to result in relapse.Project 1: Herein, I identified DNA-PK as a target for radiosensitization in the initial treatment of G3-MB to prevent relapse. DNA-PK was identified as a target in an in vitro screen, where its inhibition was shown to significantly radiosensitive G3-MB compared with other DNA damage targeting compounds. Subsequent database analysis revealed high expression of DNA-PK in G3-MB, as well as a strong correlation with MYC expression. Pharmacological inhibition by peposertib or shRNA-mediated knockdown (KD) of DNA-PK in vitro increased the radiosensitivity of G3 cells by inducing apoptosis. Furthermore, mechanistic analyses revealed that pharmacological inhibition of DNA-PK together with irradiation induced a potent G2/M arrest, and a significant increase in DNA damage, measured as γH2AX foci. Analyses of 53BP1 foci suggested that this effect was driven by a decrease in activity of the non-homologous end joining (NHEJ) DNA repair pathway. In vivo treatment of orthotopic tumor-bearing mouse models of G3-MB, including G3-PDX, with a combination of the DNA-PK inhibitor peposertib and irradiation sensitized tumors compared to irradiation alone, inducing a significant survival benefit. This combination showed no major toxicity (weight and blood testing) in pediatric mouse models. Overall, our results identify the specific DNA-PK inhibitor peposertib as a potential radiosensitizer in high-risk group 3 MB. [Peposertib was provided by Merck (CrossRef Funder ID: 10.13039/100009945)].Project 2: In this project, I constructed in vivo models to model the process of relapse following therapy observed in patients, involving initial tumor growth, tumor shrinkage and minimal residual disease following fractionated irradiation, and eventually aggressive relapse. These models were then used to perform bulk RNAseq, single-cell RNAseq, and phosphoarray analysis of tumors at different timepoints (pre-irradiation, immediately post-irradiation, minimal residual disease, and relapse/endpoint), in order to compare the activity of tumors at different timepoints with/without irradiation. We further performed a negative CRISPR-Cas9 screen in vitro, to identify genes which allow G3 MB cells to survive irradiation. Our results have revealed significant reprogramming of tumors following irradiation.Overall, the aim of this work was to gain a better understanding of the manner in which G3 MB responds to irradiation, in order to identify novel therapeutic mechanisms, to decrease the rate the relapse by promoting the efficacy of the initial therapy.