Étude de la dysérythropoïèse dans la drépanocytose et de son impact sur la niche érythroïde

Investigating ineffective erythropoiesis in sickle cell disease and its impact on the erythroid niche

• Auteur / Autrice : Auria Godard
• Direction : Wassim El Nemer
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Physiologie et physiopathologie
• Date : Soutenance le 20/12/2023
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Anthropologie bio-culturelle, droit, éthique et santé (Marseille)
• Jury : Président / Présidente : Frédérique Verdier
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Thiago Trovati-Maciel, Benoit Faucher
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Emile van den Akker, Sandrina Kinet

Mots clés

Mots clés contrôlés

Moelle osseuse

Macrophages

Érythropoïétine

Drépanocytose

Mots clés libres

Drépanocytose

Erythropoïèse

Macrophage

Moelle osseuse

Ferroptose

Îlot érythroblastique

Sickle cell disease

Erythropoiesis

Macrophage

Bone marrow

Ferroptosis

Erythroblastic island

Résumé

La drépanocytose est une maladie génétique récessive caractérisée par des crises douloureuses de vaso-occlusion, une anémie hémolytique chronique, et une défaillance progressive des organes. Elle figure parmi les maladies monogéniques les plus répandues et les plus graves au monde. Cette pathologie est causée par une mutation dans le gène de la ß-globine aboutissant à la production d'hémoglobine anormale (HbS), qui polymérise en condition d'hypoxie, entraînant la falciformation des globules rouges (GR). Le GR est largement étudié dans la drépanocytose, puisque sa destruction dans la circulation est un contributeur majeur à l'anémie, dite périphérique. Cependant on en sait peu sur la différenciation érythroïde dans cette pathologie. Nous avons récemment démontré l'existence d'une dysérythropoïèse chez les patients drépanocytaires, caractérisée par la mort d'une proportion importante d'érythroblastes lors de la différenciation terminale, entre les stades polychromatique et orthochromatique. Les objectifs de ce projet sont de : 1. Explorer le mécanisme moléculaire sous-jacent à l'érythropoïèse inefficace dans la drépanocytose. 2. Sélectionner le protocole de culture ex vivo le plus adapté pour étudier la différenciation érythroïde terminale. 3. Étudier l'impact de l'apoptose des érythroblastes sur la niche érythroïde dans la drépanocytose. Dans la première partie de cette thèse, nous avons démontré que l'érythropoïèse inefficace était étroitement liée à l'environnement partiellement hypoxique de la moelle osseuse, qui conduit à la polymérisation de l'HbS et la séquestration cytoplasmique de la protéine chaperonne HSP70. Cette séquestration empêche la translocation de HSP70 dans le noyau, réduisant son effet protecteur sur GATA-1, et conduisant ainsi à la mort des érythroblastes lors de la différenciation terminale. De plus, par cytométrie en flux, nous avons étudié l'érythropoïèse chez des patients drépanocytaires présentant des niveaux élevés d'érythroblastes nucléés, qui sont considérés comme des indicateurs de stress médullaire. Nos observations ont révélé que ces érythroblastes circulants se trouvaient à différents stades de différenciation, avec beaucoup de variations entre les patients. De plus, pour certains patients, leur cellules cultivées ex vivo pouvaient initier et compléter la différenciation érythroïde terminale, tandis que pour d'autres, leur cellules ne pouvaient pas amorcer ce processus. Cette variabilité met en évidence la complexité de la différenciation érythroïde dans la drépanocytose et souligne donc la nécessité de poursuivre les recherches pour mieux comprendre les mécanismes sous-jacents de l'érythropoïèse inefficace dans cette pathologie. Dans la deuxième partie de cette thèse, nous avons comparé deux protocoles d'érythropoïèse ex vivo couramment utilisés : un système de culture liquide à 2 phases (2P-LC) et un système de culture liquide à 4 phases (4P-LC). Nous avons constaté que les deux protocoles pouvaient reproduire les différentes étapes de l'érythropoïèse. Cependant le système 4P-LC permettait une meilleure différentiation érythroïde avec un taux plus élevé de réticulocytes, le rendant ainsi plus adapté pour l'étude de la différenciation terminale. Enfin, dans la dernière partie de cette thèse, nous avons démontré que l'augmentation de l'apoptose des érythroblastes en différenciation terminale avait un impact négatif sur les macrophages centraux des îlots érythroblastiques. En effet, nous avons démontré que la phagocytose accrue d'un très grand nombre d'érythroblastes riches en hémoglobine pouvait entrainer la mort de ces macrophages par ferroptose. De plus, les macrophages survivants présentait un changement de polarisation, passant d'un profil anti-inflammatoire, à un profil pro-inflammatoire, ce qui pourrait contribuer potentiellement à l'environnement oxydatif de la moelle osseuse dans la drépanocytose. En conclusion [...]

Sickle cell disease (SCD) is a genetic recessive disorder, characterized by painful episodes of vaso-occlusion, chronic hemolytic anemia, and progressive organ failure. It is one of the most common and severe monogenic diseases worldwide. SCD is caused by a point mutation in the β-globin gene, leading to the expression of an abnormal hemoglobin (HbS) that polymerizes under hypoxic conditions, driving red blood cells (RBC) sickling. Peripheral RBCs are extensively studied in SCD, as hemolysis is the major contributor to anemia, but little is known about erythroid differentiation in this pathology. We recently demonstrated the occurrence of ineffective erythropoiesis in the bone marrow (BM) of SCD patients, characterized by the death of a significant proportion of erythroblasts between the polychromatic and the orthochromatic stages. The objectives of this project are to 1) Characterize the molecular mechanism underlying ineffective erythropoiesis in sickle cell disease, 2) evaluate and determine the ex vivo protocol best suited to investigate terminal differentiation, and 3) Study the impact of erythroblast apoptosis on the erythroid niche in sickle cell disease. In the first part of this thesis, we showed that ineffective erythropoiesis is tightly linked to the partial hypoxic environment of the bone marrow which leads to HbS polymerization and the cytoplasmic sequestration of heat shock protein 70 (HSP70). This sequestration prevents the translocation of HSP70 to the nucleus, which in turn hinders its protective effect on GATA-1 and ultimately results in the death of terminally differentiating erythroblasts. Furthermore, we used flow cytometry to study the erythropoiesis of patients with high levels of circulating nucleated erythroblasts, which has been described as an indicator of bone marrow stress. Through our analysis, we discovered a significant variability in the stages of differentiation exhibited by circulating nucleated erythroblasts among these patients. Moreover, while some patients' cells could undergo terminal differentiation ex vivo, others were unable to initiate this process. This variability highlights the complexity of erythroid differentiation in the context of sickle cell disease and emphasizes the need for further exploration to better comprehend the different underlying mechanisms of ineffective erythropoiesis in SCD. In the second part of this thesis, we compared the two commonly used protocols of erythropoiesis, a 2-phase (2P-LC), and a 4-phase liquid culture system (4P-LC). We observed that both protocols could recapitulate the different steps of erythropoiesis. However, the 4P-LC had a higher rate of reticulocytes and erythrocyte differentiation, making it better suited for the study of terminal differentiation. In the last part of the thesis, we showed that the increased apoptosis of terminally differentiating erythroblasts could negatively impact the central macrophages of the erythroblastic islands, as increased phagocytosis of hemoglobin-rich apoptotic erythroblasts can induce ferroptosis in resident macrophages. Furthermore, the surviving macrophages exhibited a shift of polarization from an anti-inflammatory to a pro-inflammatory profile, potentially contributing to the oxidative environment of the bone marrow in SCD. In conclusion this work highlights a new mechanism contributing to ineffective erythropoiesis in SCD, while showing that there is a high variability between patients suggesting other mechanisms may come into play as well. Importantly, our work also highlights the fact that Ineffective erythropoiesis could also impact the erythroid niche by leading to the death of central macrophages and their shift to pro-inflammatory cells which could further impede erythropoiesis and contribute to anemia in this pathology.