Optimisation du traitement des infections fongiques invasives à l’ère de la résistance aux antifongiques : mise au point d’un modèle in vivo alternatif pour tester l’efficacité thérapeutique des azolés

Optimization of the treatment of invasive fungal infections in the era of antifungal resistance : development of an alternative in vivo model to test the therapeutic efficacy of azoles

• Auteur / Autrice : Sana Jemel
• Direction : Éric Dannaoui, Kalthoum Kallel
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Pathologie et recherche clinique
• Date : Soutenance le 15/12/2022
• Etablissement(s) : Paris Est en cotutelle avec Université de Tunis El Manar
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la Vie et de la Santé (Créteil ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Dynamyc Mycology (Créteil) - Dynamic Microbiology - EA 7380 / DYNAMIC
• Jury : Président / Présidente : Françoise Botterel-Chartier
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Éric Dannaoui, Kalthoum Kallel, Guillaume Desoubeaux, Fatma Cheikhrouhou, Marie-Elisabeth Bougnoux, Akila Fathallah, Rym Ben abdallah
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Guillaume Desoubeaux, Fatma Cheikhrouhou

Mots clés

Mots clés contrôlés

Aspergillose

Azoles

Résistance aux antifongiques

Mots clés libres

Galleria mellonella

Azoles

Aspergillus

Résumé

L’aspergillose invasive (AI) est une pathologie grave dont la prise en charge est compliquée du fait de l’émergence des résistances au traitement de première ligne (azolés). Ces résistances sont liées aux traitements antifongiques (ATF) aux long cours chez les patients et à la sélection dans l’environnement par l’utilisation de fongicides en milieu agricole. Des alternatives sont indispensables pour la prise en charge des AI. Les associations d’ATF représentent une piste thérapeutique intéressante mais qui doit être validée in vivo. Par ailleurs, dans de nombreux pays et notamment en Tunisie, l’épidémiologie des résistances aux azolés chez Aspergillus reste peu connue.L’objectif de ma thèse était de développer un modèle d’AI chez Galleria mellonella pour évaluer l’efficacité de nouvelles stratégies thérapeutiques et de dépister des souches résistantes d’Aspergillus spp. aux azolés à partir de souches cliniques et environnementales en Tunisie.Nous avons utilisé 3 souches cliniques d’Aspergillus fumigatus (Af) : AfS (sensible à tous les azolés), AfR1(sensible au voriconazole (VRZ), résistante au posaconazole (PSZ)) et AfR2 (R au VRZ et PSZ). Des groupes de 10 larves de Gm ont été infectés par la dose létale correspondante à chaque souche. Les groupes de larves ont été d’abord traités en monothérapie par de l’amphotéricine B (AMB, 0,5 à 4 µg/larve), du VRZ (0,5 à 8 µg/larve), de la caspofungine (CAS 1 à 8 µg/larve) et du PSZ (1 à 8 µg/larve). L’efficacité était évaluée par la mortalité et sur des coupes histopathologiques. Pour tester les associations, les groupes de larves ont été traités par VRZ ou PSZ à 4 μg/larve en monothérapie ou bien en association avec de la CAS à 4, 2 ou 1 μg/larve.La mortalité des larves non traitées était ≥ 95% pour les 3 souches. Une diminution dose dépendante de la mortalité était obtenue par le traitement ATF. Le VRZ était plus efficace pour les larves infectées par les souches sensibles au VRZ (60% de mortalité) que pour les souches résistantes (95% de mortalité). Sur les coupes histologiques et après traitement par le VRZ, les lésions étaient moins disséminées pour AfS que pour AfR2. Le traitement par PSZ a augmenté la survie pour AfS et AfR1 mais pas pour les larves infectées par AfR2. L’association VRZ plus CAS avait un apport significatif par rapport au VRZ seul pour le traitement des larves infectées par AfR2 mais pas pour AfS ou AfR1. L’association PSZ + CAS a augmenté significativement la survie des larves infectées par AfR2 comparé à la monothérapie par CAS ou PSZ.En Tunisie, Nous avons collecté des souches cliniques d’Aspergillus spp., isolées chez des patients et des souches environnementales isolées de prélèvements de sol et d’air. Un criblage des souches résistantes aux azolés a été réalisé sur un milieu de culture contenant des antifongiques. Pour les souches qui ont poussé en présence d’azolés, la CMI a été déterminée par des bandelettes à gradient de concentration et par la technique de référence de dilution en milieu liquide EUCAST.Nous avons collecté 1063 souches d’Aspergillus spp. à partir de prélèvements d’air et de sol. Af et A. flavus représentaient 19 et 5% des souches respectivement. A. niger était l’espèce la plus fréquente (36.6%). Le screening a été réalisé pour 112 souches cliniques (87 A. flavus et 25 Af) et pour 26 souches environnementales (11 A. flavus et 25 Af). Seulement deux souches cliniques d’Af isolées à partir de lavage bronchoalvéolaire de deux patients avaient des CMI à 8 µg/mL pour VRZ et ITZ.G. mellonella est un modèle adapté et intéressant pour l’évaluation de nouvelles stratégies thérapeutiques. Nous avons montré que des associations de CAS avec les azolés permettait d’améliorer la survie des larves infectées par des souches résistantes d’Af. Nous avons également montré que la résistance aux azolés était présente en Tunisie chez des souches d’origine clinique.

Invasive aspergillosis (IA) is a serious pathology whose management is complicated by the emergence of resistance to first-line treatment (azoles). These resistances are related to long-term antifungal treatments (AFT) in patients and to environmental selection through the use of fungicides in agricultural settings. Alternatives are essential for management of IA. Combinations of AFT represent an interesting therapeutic option that must be validated in vivo. Moreover, in many countries, and particularly in Tunisia, the epidemiology of resistance to azoles in Aspergillus remains poorly studied. The aim of my thesis was to develop an IA model in G. mellonella (Gm) to evaluate the effectiveness of new therapeutic strategies and to detect resistant strains of Aspergillus spp. to azoles from clinical and environmental strains in Tunisia.We used 3 clinical strains of Aspergillus fumigatus (Af): AfS (azole-susceptible), AfR1 (voriconazole (VRZ) susceptible, posaconazole (PSZ) resistant) and AfR2 (resistant to VRZ and PSZ). Groups of 10 Gm larvae were infected with the corresponding lethal dose for each strain. The larval groups were initially treated with monotherapies with amphotericin B (AMB, 0.5-4 µg/larva), VRZ (0.5-8 µg/larva), caspofungin (CAS 1-8 µg/larva) and PSZ (1-8 µg/larva). Efficacy was assessed by mortality and on histopathological sections. Groups of larvae were treated with VRZ or PSZ at 4 μg/larvae as monotherapy or in combination with CAP at 4, 2 or 1 μg/larva.Mortality of untreated larvae was > 95% for all 3 strains. A dose-dependent mortality decrease was obtained through AFT treatment. VRZ was more effective for larvae infected with VRZ-susceptible strains (60% mortality) than for resistant strains (95% of mortality).On histological sections and after VRZ treatment, lesions were less disseminated for AfS-infected larvae compared to AfR2. Treatment with PSZ increased survival for AfS and AfR1 but not for AfR2 infected larvae. The combination VRZ and CAS had a significant contribution compared to VRZ alone for the treatment of AfR2 but not for AfS or AfR1 infected larvae. The combination of PSZ and CAS significantly increased survival of AfR2-infected larvae compared to CAS and PSZ monotherapy.In Tunisia, we collected clinical strains of Aspergillus spp. isolated from patients and environmental strains isolated from soil and air samples. A screening of azole resistant strains was carried out on a culture medium containing antifungals. For strains that grew in the presence of azoles, the MIC was determined by concentration gradient strips and by the EUCAST liquid dilution reference technique.We collected 1063 strains of Aspergillus spp. from air and soil sampling. Af and A. flavus represented 19 and 5% of the strains respectively. A. niger was the most common species (36.6%). Screening was carried out for 112 clinical strains (87 A. flavus and 25 Af) and 26 environmental strains (11 A. flavus and 25 Af). Only two clinical strains of Af isolated from bronchoalveolar lavage of two patients had MIC at 8 µg/mL for VRZ and ITZ.G. mellonella is a suitable and interesting model for evaluating new therapeutic strategies. We showed that CAS associations with azoles improved the survival of larvae infected with resistant strains of Af. We also showed that resistance to azoles was present in Tunisia in strains of clinical origin.