Méthylation de l'ADN, différenciation tardive des lymphocytes B et réponse humorale

DNA methylation, late B cell differentiation and humoral immune response

• Auteur / Autrice : Clara Cousu
• Direction : Sébastien Storck
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Immunologie
• Date : Soutenance le 12/06/2023
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Necker Enfants-Malades (Paris ; 2014-....)
• Jury : Président / Présidente : Capucine Picard
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Déborah Bourc'his
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Pierre Milpied, Thierry Fest

Mots clés

Mots clés contrôlés

Méthylation de l'ADN

Cellules B mémoire

Épigénétique

Rétrotransposons

Syndromes de déficit immunitaire

Méthylome

Anticorps

Lymphocytes B

Plasmocytes

Centre germinatif

Mots clés libres

Centres germinatifs

Plasmocytes

Lymphocytes B mémoires

Anticorps

Méthylation de l'ADN

Syndrome ICF

HELLS

Rétrotransposons

Epigénétique

Germinal center

Plasma cells

Memory B cells

Antibodies

DNA methylation

ICF syndrome

HELLS

Retrotransposons

Epigenetics

Résumé

Les anticorps et lymphocytes B mémoires représentent ensemble les effecteurs ultimes de la réponse immunitaire médiée par les lymphocytes B, définies sous le terme de réponse humorale. Tous deux sont les produits finaux d'une différenciation tardive des cellules B, lors de laquelle surviennent des cycles intenses de prolifération, des modifications de l'ADN, ainsi qu'une sélection clonale lors de la réaction de centre germinatif. Mon travail s'est centré sur le déchiffrement du mécanisme par lequel la méthylation de l'ADN affecte la différenciation tardive des lymphocytes B. Pour cela, nous avons choisi d'étudier une immunodéficience très rare nommée ICF (Immunodeficiency, centromeric instability, and facial anomalies) de type 4, où une mutation perte de fonction ponctuelle dans le gène codant la protéine HELLS, un remodeleur de chromatine de type SNF2, provoque une hypo voire agammaglobulinémie ainsi qu'un défaut de cellules B mémoires circulantes. En conséquence, ces patients présentent des infections respiratoires et gastro-intestinales récurrentes et ne répondent pas à la vaccination, malgré un nombre normal de cellules B circulantes. Plus généralement, HELLS a été associé à une voie de méthylation de l'ADN, impliquant d'autres gènes connus pour causer le syndrome ICF en cas de mutations perte de fonctions : DNMT3B (ICF de type 1), ZBTB24 (ICF de type 2) et CDCA7 (ICF de type 3). Les patients souffrant du syndrome ICF présentent des défauts moléculaires typiques causés par une hypométhylation de l'ADN tels que des chromosomes multi-branchés causés par la décondensation de la chromatine dans les régions péri-centromériques des chromosomes 1, 9 et 16. Dans l'ensemble, un mécanisme de méthylation de l'ADN fonctionnel semble crucial pour monter une réponse humorale spécifique et durable. En utilisant un knock-out conditionnel de HELLS spécifique des cellules B (Hellsᶜᴷᴼ) dans des modèles murins, nous avons pu décortiquer la cinétique d'une réponse immunitaire typique afin de mieux délimiter l'origine du déficit constaté chez les patients. Nous avons d'abord confirmé que les lymphocytes B déficients pour HELLS ne présentent pas d'anomalies de développement dans la moelle osseuse, mais nous avons observé que les souris mutantes présentent une fréquence réduite de la population B1-a au sein de la cavité péritonéals. Lors d'une immunisation avec l'antigène T-dépendant NP-CGG, les souris Hellsᶜᴷᴼ ont un taux de lymphocytes B mémoires et de plasmocytes diminué, voir quasi nul. Ce manque est accompagné d'un défaut de maintien des centres germinatifs, bien que leur formation ne soit pas affectée. J'ai caractérisé la réaction des centres germinatifs spécifiquement chez les souris Mb1Hellsᴷᴼ et montré que les cellules B Hellsᶜᴷᴼ subissent une hypométhylation importante de l'ADN suivi d'une dérépression massive de rétrotransposons, sans pour autant engendrer plus de mort cellulaire apoptotique. L'absence de HELLS n'a pas d'incidence sur la maturation d'affinité, la séparation zone claire/ zone sombre, ni sur la capacité proliférative des cellules. Au lieu de cela, les cellules B du centre germinatif Hellsᶜᴷᴼ régulent positivement une signature mémoire et un programme métabolique de réponse à un stress du réticulum appelé Unfolded protein response UPR -mTORC1 typique des plasmocytes, expliquant leur disparition précoce. Nous montrons que chez les souris déficientes en HELLS, cette hyperactivation de la voie UPR-mTORC1 dépend du facteur de transcription ATF4, dont le rôle lors de la différenciation en plasmocytes sécréteurs d'anticorps n'avait jamais été démontré auparavant. Nous émettons l'hypothèse que cette signature est l'apparition précoce d'une cascade moléculaire conduisant à la différenciation terminale en plasmocytes. De plus, j'ai confirmé le rôle du maintien de la méthylation de l'ADN sur la cinétique du centre germinatif en utilisant un inhibiteur spécifique de DNMT1, récapitulant les caractéristiques du phénotype Hellsᶜᴷᴼ.

Antibodies and memory, together represent the ultimate effectors of the B cell immune response, known as the humoral immune response. Both are the end products of the late B cell differentiation, in which cells undergo intense proliferation, DNA modifications and clonal selection inside germinal centers. My work has been centered around deciphering the mechanism by which DNA methylation affects terminal B cell differentiation. For this, we chose to study a very rare immunodeficiency called ICF (Immunodeficiency, Centromeric instability, and Facial anomalies) type 4, where a point mutation in a gene encoding the protein HELLS, a SNF2-like chromatin remodeler, causes a hypo/agammaglobulinemia and a lack of memory B cells in patients. As a result, these patients present frequent respiratory and gastro-intestinal infections and do not respond to vaccination, even though they have normal circulating B cell counts. More generally, HELLS has been associated with DNA methylation pathway, involving other genes known to cause ICF syndrome in case of loss-of-function mutations: DNMT3B (ICF1 type 1), ZBTB24 (ICF type 2) and CDCA7 (ICF type 3). Patients suffering from ICF have typical molecular defects caused by lack of DNA methylation such as multiradial chromosomal figures caused by chromatin decondensation in pericentromeric regions of chromosomes 1, 9 and 16. Overall, the need for proper DNA methylation seems crucial to mount a lasting specific humoral response. By using B-cell specific HELLS conditional knock-out (Hellsᶜᴷᴼ) in murine models, we were able to break down the kinetics of a typical immune response to better understand the origin of the deficiency found in patients. We first confirmed that HELLS deficient B cells do not show anomalies in bone-marrow B cell development, but we observed that mice showed a reduced frequency of B1-a peritoneal cavity population. Upon NP-CGG immunization, Hellsᶜᴷᴼ mice show a lack of memory and plasma cells accompanied by a defect in germinal center maintenance, even though their formation is not impacted. I characterized the germinal center reaction specifically in Mb1Hellsᴷᴼ mice and show that Hellsᴷᴼ B cells undergo dramatic DNA hypomethylation, massive derepression of retrotransposons, without showing increased apoptotic cell death. Lack of HELLS does not impact affinity maturation, light zone dark zone segregation nor cell cycling capacities. Instead, Hellsᴷᴼ germinal center B cells upregulate a memory signature and an Unfolded Protein Response (UPR)-mTORC1 metabolic program typical of plasma cells, explaining their early decay. We found that in HELLS deficient mice, the UPR-mTORC1 pathway involved is dependent on ATF4, which has never been shown in plasma cell differentiation. We hypothesize that this signature is an early onset of a molecular cascade leading to plasma cell terminal differentiation. Additionally, I confirmed the role of DNA methylation maintenance on germinal center kinetics by using a DNMT1-specific inhibitor, which recapitulated hallmarks of the HELLS knock-out phenotype.