Étude fonctionnelle de la rupture vacuolaire de Shigella flexneri par analyse ultrastructurale in situ

Functional investigation of Shigella flexneri vacuolar rupture through in situ ultrastructural analysis

• Auteur / Autrice : Léa Swistak
• Direction : Jost Enninga
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Infectiologie
• Date : Soutenance le 14/12/2023
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Unité de Dynamique des interactions hôte-pathogène (Paris)
• Partenaire(s) de recherche : Structure de recherche : Institut Pasteur. Département de Biologie cellulaire et infection (2006-….)
• Jury : Président / Présidente : Carmen Buchrieser
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Lena Pernas, Serge Mostowy
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Eric Cascales, Julia Mahamid

Mots clés

Mots clés contrôlés

Systèmes de sécrétion de type III

Vacuoles

Shigella flexneri

Mots clés libres

Shigella flexneri

Système de Sécrétion de Type III

Vacuole bactérienne

Dommages membranaires

Cryotomographie électronique

Microscopie en corrélative

Shigella flexneri

Type III Secretion System

Bacterial containing vacuole

Membrane damage

Cryo-Electron tomography

Correlative light-Electron microscopy

Résumé

Les agents pathogènes intracellulaires s'établissent dans des endroits spécifiques à l'intérieur des cellules cibles, appelés niches intracellulaires. Après leur entrée dans la cellule hôte, la première niche de tous les pathogènes bactériens est un compartiment membranaire, connu sous le nom de vacuole contenant des bactéries (VCB). Certains agents pathogènes ont la capacité de s'échapper de cette niche vacuolaire pour se multiplier dans le cytosol de la cellule hôte. Cette transition d'une niche à l'autre joue un rôle essentiel dans la progression des infections. L'une de ces bactéries est Shigella flexneri, agent responsable de la dysenterie bacillaire (shigellose) chez l'homme. L'invasion des cellules eucaryotes par Shigella repose l'action système de sécrétion de type III (SST3), une seringue moléculaire appelée « l'aiguille du SST3 ». Ce système injecte plus de 20 effecteurs bactériens dans les cellules hôtes, lesquels agissent en synergie pour remodeler les voies critiques de la cellule hôte, favorisant ainsi les étapes successives de l'invasion et de la formation de niches intracellulaires. La caractéristique de la formation de niches intracellulaires par Shigella est son évasion efficace dans le cytosol de la cellule hôte où elle se développe et se propage de cellule en cellule. Des travaux antérieurs ont montré que la rupture de la VCB de Shigella implique des événements séquentiels, commençant par un endommagement initial de la VCB suivi de la séparation complète des membranes brisées de la VCB de la bactérie. La dissociation de la membrane a été étudié de façon assez détaillée, mais la manière dont les dommages initiaux de la membrane de la VCB se produisent est restée insaisissable. Le rôle direct du SST3 dans le contexte de la rupture de la vacuole de Shigella et de la formation subséquente d'une niche cytosolique doit être caractérisé avec précision. Pour comprendre comment le SST3 est impliqué dans les premières étapes des dommages causés à la VCB, nous avons développé un pipeline de microscopie en corrélative cryo-CLEM (Correlative Light Electron Microscopy), combinant la cryo-microscopie électronique à transmission et l'imagerie par cryo-fluorescence. Cela a permis d'obtenir des informations fonctionnelles à l'échelle cellulaire et des données ultrastructurales dans des conditions proches de l'état natif. J'ai appliqué ce pipeline cryo-CLEM in situ pour imager pour la première fois les premières étapes successives de l'invasion des cellules épithéliales par Shigella à haute résolution. Au cours de ces événements, nous avons résolu le SST3 de Shigella et sa distribution à la surface de la bactérie, sa morphologie et ses dimensions au cours de l'infection. En appliquant le pipeline à différents moments de l'infection, j'ai été en mesure d'imager les stades de rupture vacuolaire avant et au début de l'infection, ce qui a permis d'identifier la rupture locale de la membrane de la VCB. De plus, j'ai analysé la morphologie de la membrane de la VCB à proximité du SST3 afin de corréler la présence du SST3 et les dommages membranaires. Enfin, en utilisant une approche de biologie synthétique avec des E. coli exprimant un SST3 réduit de Shigella, j'ai pu identifier les facteurs bactériens minimaux nécessaires pour endommager la VCB. Dans l'ensemble, j'ai pu récapituler les étapes de la rupture de la VCB de Shigella au niveau ultrastructural, offrant ainsi une nouvelle perspective sur les processus menant à la rupture vacuolaire. Ce travail décrit, au niveau des complexes moléculaires, la pertinence des premières étapes de la rupture vacuolaire dans la formation de la niche intracellulaire d'un pathogène cytosolique.

Intracellular pathogens establish themselves in specific locations within targeted cells, referred to as intracellular niches. The first niche upon cellular uptake for all bacterial pathogens is a membrane-enclosed compartment known as the Bacterial Containing Vacuole (BCV). Some pathogens possess the ability to escape from this vacuolar niche to the host cell cytosol to multiply, this transition plays a critical role in infection progression. One of these bacteria is Shigella flexneri, responsible for bacillary dysentery (shigellosis) in humans. Shigella invasion of eukaryotic cells relies on a syringe-like nanomachine called the Type III Secretion System (T3SS). It injects over 20 bacterial effectors into host cells that synergistically reshape critical host cell pathways to promote the successive steps of invasion and intracellular niche formation. The hallmark of Shigella intracellular niche formation is its efficient escape into host cell cytosol where it grows and spreads from one cell to another. Previous work has shown that Shigella BCV rupture involves sequential events, starting with an initial damage of the BCV followed by the complete unwrapping of the broken BCV membranes from the bacteria. The membrane unpeeling has been studied in some detail; however how initial BCV membrane damage occurs has remained elusive. Precisely, the direct role of the T3SS in the context of Shigella vacuole disruption and subsequent cytosolic niche formation needs to be characterized. To understand how the T3SS is involved in the first steps of BCV damage, we developed a cryo- Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) pipeline linking cryo-transmission electron microscopy to cryo-fluorescence imaging. This provided both cellular-scale functional information and ultrastructural data in near native conditions. I applied this cryo-CLEM pipeline in situ to image for the first time the successive early steps of Shigella invasion of epithelial cells at high resolution. During these events, we resolved Shigella T3SS and its distribution at the bacterial surface, its morphology, and its dimensions during infection. By applying the pipeline at different infection timepoints I was able to image pre and early vacuolar rupture stages which identified local BCV membrane disruption. Furthermore, I analyzed the BCV membrane morphology at the vicinity of T3SS aiming to correlate T3SS presence and membrane damage. Finally, using a synthetic biology approach with E. coli expressing a reduced T3SS of Shigella, I could identify the minimal bacterial factors required for BCV damage. Altogether I was able to recapitulate the steps of Shigella BCV rupture at the ultrastructural level offering a new perspective on the processes leading to vacuolar rupture. This work depicts, at the level of molecular complexes, the relevance of the first steps of vacuolar disruption in the intracellular niche formation of a cytosolic pathogen.