Exploration des mécanismes moléculaires de la reprogrammation directe d'astrocytes en neurones induits GABAergiques

Deciphering the molecular mechanisms of direct lineage reprogramming of astrocytes into GABAergic induced neurons

• Auteur / Autrice : Marie-Madeleine Trottmann
• Direction : Christophe Heinrich
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Neurosciences
• Date : Soutenance le 15/12/2023
• Etablissement(s) : Lyon 1
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale de Biologie Moléculaire Intégrative et Cellulaire (Lyon ; 1999-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Cellule Souche et Cerveau (Bron)
• Jury : Président / Présidente : Carole Kretz
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Christophe Heinrich, Sophie Jarriault, Sergio Gascón
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Sophie Jarriault, Sergio Gascón

Mots clés

Mots clés contrôlés

Séquençage de l'ARN

Phosphorylation oxydante

Reprogrammation cellulaire

Astrocytes

Mots clés libres

Reprogrammation directe

Astrocytes

Neurones induits GABAergiques

Séquençage ARN

Direct lineage reprogramming

Astrocytes

GABAergic induced neuron

RNA sequencing

Résumé

Le système nerveux central des mammifères ne possède pas la capacité de régénérer les neurones perdus suite à une lésion ou à une neurodégénération. Afin de pallier ce manque, une stratégie émergente de réparation cérébrale consiste à convertir des cellules gliales résidantes du cerveau en neurones induits (iNs) fonctionnels, par reprogrammation cellulaire directe. Cette reprogrammation peut être réalisée en induisant l’expression de facteurs de transcription neurogéniques. Les astrocytes représentent des cibles idéales : ils prolifèrent suite à un dommage cérébral, et leur origine cellulaire commune avec les neurones pourrait faciliter leur reprogrammation. Un avantage de la reprogrammation directe d’astrocyte en iN est de pouvoir induire un phénotype neuronal précis, grâce à une combinaison de facteurs de transcription adaptée. Cette reprogrammation représente une stratégie prometteuse pour le remplacement de neurones perdus, mais la compréhension de ses mécanismes reste limitée. L’objectif de ma thèse est de disséquer les mécanismes moléculaires sous-tendant la reprogrammation d’astrocytes en iNs GABAergiques. J’ai montré que l’expression des facteurs de transcription Ascl1 et Dlx2 induit efficacement la reprogrammation d’astrocytes en iNs GABAergiques. J’ai ensuite montré par single cell RNA-Sequencing que les astrocytes exprimant les facteurs de transcription Ascl1 et Dlx2, ou Dlx2 seul, présentent deux trajectoires transcriptionnelles alternatives conduisant à leur reprogrammation en iNs GABAergiques. Ces trajectoires, établies par analyse pseudo-temporelle, permettent l’identification d’états intermédiaires distincts au cours de la reprogrammation. La première trajectoire est composée d’une première étape durant laquelle les cellules de départ, présentant un profil d’astrocytes matures, perdent l’expression de leurs marqueurs d’identité gliale et expriment de manière transitoire des gènes associés aux cellules souches neurales. La transition de l’état astrocytaire au premier état intermédiaire s’accompagne d’une activité liée à la transcription et traduction ainsi qu’à un métabolisme glycolytique et lipidique accru, mais aussi d’une forte expression de composants mitochondriaux. Le second état intermédiaire se caractérise par l’expression de gènes impliqués dans la différenciation neuronale ainsi que dans le stress oxydatif. Ces observations, ainsi que celle d’une diminution d’expression des gènes liés à la glycolyse, précise la mise en place du changement métabolique profond nécessaire pour la transition d’un métabolisme glial glycolytique à l’acquisition d’un métabolisme neuronale reposant sur la phosphorylation oxydative. La seconde trajectoire montre une transition de l’astrocyte à un état intermédiaire cyclant. Ces cellules, ayant perdu l’expression de leurs gènes gliaux, présentent l’expression de gènes neuronaux et liés au lignage GABAergique. La transition de l’astrocyte à l’iN GABAergic s’accompagne également d’une reprogrammation épigénétique, observée à l’échelle transcriptionnelle par l’expression graduelle de gènes liés au remodelage chromatinien, ainsi qu’au changement de profil d’expression d’ARN non codants. En conclusion, mes travaux apportent une description précise des mécanismes moléculaires sous-tendant la reprogrammation directe d’astrocytes en neurones induits GABAergiques. L’utilisation de séquençage ARN à l’échelle de la cellule unique m’a permis d’explorer en détail la dynamique d'expression des gènes au cours du processus de reprogrammation. L’identification des voies métaboliques et épigénétiques impliquées dans cette reprogrammation permet d’aiguiller de futures explorations fonctionnelles qui permettront de mieux comprendre et d’optimiser ce processus. Enfin, ce travail apporte des connaissances essentielles dans l’optique d’une translation potentielle de cette reprogrammation d’astrocytes en neurones induits comme stratégie thérapeutique chez l’homme.

The adult mammalian brain lacks the intrinsic capacity for self-repair following injury or neurodegeneration. To tackle this issue, direct lineage reprogramming of glial cells into induced neurons (iNs) has emerged as a promising strategy. Astrocytes appear as ideal candidates for this reprogramming, as they proliferate following injury in the central nervous system and share a common progenitor ancestor with neurons. Astrocytes were shown to be converted into specific subtypes of iNs by forced overexpression of distinct neurogenic transcription factor combinations. Glia-to-iN conversion has emerged as a promising strategy toward brain repair, but molecular mechanisms underlying this process remain largely unknown. Thus, the goal of my PhD is to describe the molecular mechanisms underlying astrocyte reprogramming into GABAergic iNs. I showed that forced expression of the neurogenic transcription factors Ascl1 and Dlx2 efficiently converted astrocytes into GABAergic iNs. Using single cell RNA sequencing and pseudo-temporal analysis, I showed that astrocyte reprogramming into GABAergic iNs follows two alternative reprogramming trajectories transitioning through intermediate cell states. In the first trajectory, the first step of reprogramming is characterized by downregulation of astrocyte identity genes expressed in the control cell population, and transient overexpression of neural stem cell related genes. Transition from astrocytes to this first intermediate state is also related to an increase in gene expression and protein translation, as well as profound metabolic changes, with transient increase in glycolysis and lipid metabolism accompanied by mitochondrial gene expression. The second intermediate state of this trajectory is characterized by expression of genes linked to neuronal differentiation and oxidative stress, along with the downregulation of glycolysis related genes. These observations highlight the metabolic changes underlying reprogramming of glycolytic astrocytes into iNs relying on oxidative-phosphorylation. The second reprogramming trajectory comprises a transient cycling state. Cells in this state have down-regulated their glial genes and started to express neuronal genes and GABAergic lineage markers. In addition, astrocyte reprogramming into GABAergic iNs implies epigenetic remodeling, which can be observed by expression of genes linked to chromatin modifications and non-coding RNAs. In conclusion, my work provides new insights into the molecular mechanisms underlying direct lineage reprogramming of astrocytes into GABAergic iNs. Single cell RNA sequencing allowed in-depth exploration of the gene expression dynamics taking place during the reprogramming process. Identification of metabolic and epigenetic pathways involved in reprogramming opens the way for future functional investigations aiming at increasing the efficiency of this process. This work brings important new knowledge for the translational perspective of direct lineage reprogramming as a potential therapeutic strategy toward brain repair.