Transport du manganèse chez Arabidopsis : Régulation post-traductionnelle du transporteur de manganèse NRAMP1

Manganese transport in Arabidopsis : post-translational regulation of the manganese transporter NRAMP1

• Auteur / Autrice : Thibault Kosuth
• Direction : Catherine Curie
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie des systèmes
• Date : Inscription en doctorat le ; Soutenance le 31/05/2023
• Etablissement(s) : Université de Montpellier (2022-....)
• Ecole(s) doctorale(s) : École Doctorale GAIA Biodiversité, agriculture, alimentation, environnement, terre, eau (Montpellier ; 2015-...)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : IPSiM - Institut des Sciences des Plantes de Montpellier
• Jury : Président / Présidente : Jean Colcombet
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Catherine Curie, Loren Castaings, Sylvain Merlot, Laurence Marques, Thierry Desnos
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Sylvain Merlot, Jean Colcombet

Mots clés

Mots clés libres

Phosphorylation

Ubiquitination

Manganèse

Transport

Kinase

Cipk

Phosphorylation

Ubiquitination

Manganese

Transport

Kinase

Cipk

Résumé

Le manganèse (Mn) est un micronutriment métallique essentiel pour l’ensemble des organismes vivants. Chez les plantes, il intervient comme cofacteur de nombreuses enzymes impliquées dans des voies métaboliques majeures. La biodisponibilité du Mn dans le sol est cependant variable et sa carence, comme son excès, peuvent constituer des facteurs limitants pour la croissance des plantes. Afin de s’adapter à ces fluctuations, celles-ci bénéficient d’une multitude de transporteurs contrôlant l’absorption racinaire du Mn et sa distribution vers les différents organites de la cellule. Le maintien de l’homéostasie cellulaire du Mn repose notamment sur la régulation de la localisation ou de l’activité de ces transporteurs. Chez Arabidopsis thaliana, l’absorption de Mn à haute affinité est principalement assurée par le transporteur NRAMP1, dont la localisation subcellulaire dépend de la disponibilité du métal. Le transporteur est stabilisé à la surface des cellules en condition de carence et cycle rapidement entre la membrane plasmique et les endosomes face à un excès de Mn selon un mécanisme phosphorylation-dépendant. Sur la base de ces connaissance, mes travaux de thèse ont visé à approfondir la caractérisation des mécanismes de régulation post-traductionnelle de NRAMP1 en réponse au Mn chez Arabidopsis. L’objectif de mon premier axe de recherche a été de déterminer l’implication de l’ubiquitination dans la régulation de NRAMP1 et d’identifier les enzymes et résidus du transporteur impliqués dans cette régulation. Mon second axe de recherche a visé à identifier les kinases contrôlant la phosphorylation de NRAMP1 et caractériser le contexte et le rôle de ces mécanismes dans la régulation du transporteur en réponse au Mn. J’ai employé au cours de ma thèse un large spectre d’approches biochimiques, protéomiques et de mutagénèse dirigée afin de répondre à ces questions. Afin d’identifier des enzymes impliquées dans l’ubiquitination ou la phosphorylation de NRAMP1, j’ai cherché à recenser les partenaires protéiques du transporteur au travers d’approches sans à priori de type interactome et d’approches gènes candidats. Ces dernières se sont concentrées sur les familles de kinases CIPKs et CPKs activées par le calcium et ont permis d’établir CIPK23 comme candidate principale. Des expériences de phosphorylation in vitro couplées à des approches de génétique inverse m’ont ensuite permis de démontrer que cette kinase phosphoryle les Ser20 et 499 N- et C-terminales de NRAMP1. Des analyses physiologiques m’ont amené à la conclusion que CIPK23 est susceptible de contrôler l’activité du transporteur en fonction du statut Mn de la plante. Mes recherches sur la régulation de NRAMP1 par phosphorylation et ubiquitination ont ainsi contribué à une meilleure compréhension des mécanismes complexes soutenant l’homéostasie du Mn chez la plante.

Manganese (Mn) is an essential metallic micronutrient for all living organisms. In plants, it acts as a cofactor for many enzymes involved in major metabolic pathways. However, the bioavailability of Mn in the soil is variable and its deficiency or excess can be limiting for plant growth. In order to adapt to these fluctuations, plants benefit from many transporters controlling root absorption of Mn and its distribution to the various organelles of the cell. The maintenance of Mn cellular homeostasis relies notably on the regulation of the localization or activity of these transporters. In Arabidopsis thaliana, high-affinity Mn uptake is mainly mediated by the transporter NRAMP1, whose subcellular localization depends on the metal availability. NRAMP1 is stabilized at the cell surface under Mn starvation and rapidly cycles between the plasma membrane and the endosomes in response to Mn excess through a phosphorylation-dependent mechanism. Based on this knowledge, my thesis work aimed to deepen the characterization of NRAMP1 post-translational regulatory mechanisms in response to Mn in Arabidopsis. The objective of my first research axis was to determine the involvement of ubiquitination in the regulation of NRAMP1 and to identify the enzymes and transporter residues involved in this process. My second research axis aimed to identify kinases controlling NRAMP1 phosphorylation and to characterize the context and the role of these mechanisms in the regulation of the transporter in response to Mn. During my thesis, I used a wide spectrum of biochemical, proteomic and site-directed mutagenesis strategies to answer these questions. In order to identify enzymes involved in the ubiquitination or phosphorylation of NRAMP1, I sought for protein partners of the transporter through interactome-based untargeted approaches and candidate gene approaches. The latest focused on the calcium-activated CIPKs and CPKs kinases families and established CIPK23 as a main candidate. In vitro phosphorylation experiments coupled with reverse genetics approaches allowed me to demonstrate that CIPK23 phosphorylates Ser20 and 499 on the N- and C-termini of NRAMP1. Physiological analyzes led me to the conclusion that CIPK23 is likely to control the activity of the transporter depending on the Mn status of the plant. Thus, my research on NRAMP1 regulation by phosphorylation and ubiquitination has contributed to a better understanding of the complex mechanisms supporting Mn homeostasis in plants.