Effet d'un défaut du système de réparation des mésappariements sur l'occurrence des métastases modélisé dans un modèle murin syngénique

Effect of MisMatch Repair Deficiency on metastasis occurrence modelized in a syngeneic mouse model

• Auteur / Autrice : Pierre Laplante
• Direction : Patricia Kannouche, Sergey Nikolaev
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences du Cancer
• Date : Soutenance le 16/12/2024
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Cancérologie, Biologie, Médecine, Santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Intégrité du génome et cancers (Villejuif, Val-de-Marne ; 2010-....) - Prédicteurs moléculaires et nouvelles cibles en oncologie (Villejuif, Val-de-Marne ; 2010-....)
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Faculté de médecine
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Life Sciences and Health (2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Alex Duval
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jean-Charles Cadoret, Elsa Bernard, Aymeric Silvin
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Alex Duval, Jean-Charles Cadoret

Mots clés

Mots clés contrôlés

Transition épithélio-mésenchymateuse

Réparation de mésappariement de l'ADN

RNA-Seq

Microenvironnement tumoral

Réplication de l'ADN

Réponse immunitaire

Transcriptome

Métastases

Mots clés libres

Réplication de l'ADN

Réparation des mésappariement

Métastases

Microenvironnement tumoral

Transcriptomie

DNA replication

Mismatch repair

Metastasis

Tumor microenvironment

Transcriptomics

Résumé

Contexte : Le cancer colorectal (CCR) déficient en réparation des mésappariements (MMR-D), hypermuté et aux microsatellites instables (MSI) est moins enclin au développement de métastases, et présente un pronostic défavorable après récidive, par rapport au CCR aux microsatellites stables (MSS). Les mécanismes derrière ces deux phénomènes sont encore inexpliqués, principalement en raison du manque d'un bon modèle in vivo de cancer métastatique MSI.Méthodes : Nous avons inactivé le gène Msh2 dans la lignée cellulaire de cancer du sein 4T1luc+, exprimant la luciférase. Le phénotype MMR-D, marqué par une accumulation de mutations ponctuelles à l'échelle du génome et d'insertion-délétion (indels) aux sites de microsatellites, a été établi par des passages sériels in vitro avant l'injection orthotopique dans le coussinet adipeux mammaire inférieur gauche de souris BALB/c. Le développement métastatique a été suivi par imagerie in vivo de l'activité luciférase. Les tumeurs primaires des souris, ayant développé des métastases ou non, ont été séquencées, et des analyses génomiques et transcriptomiques menées. La caractérisation des cellules CD45+ a été réalisée par cytométrie en flux spectrale sur les tumeurs primaires, les sites secondaires (tissu pulmonaire), la moelle osseuse et le sang, avant et après l'implantation tumorale, afin de mieux comprendre les différents microenvironnements associés.Résultats : Une différence significative dans l'apparition des métastases a été observée entre souris porteuses de tumeurs MSS et MSI (100 % contre 82,3 %, p = 0,0456). De plus, les souris présentant des métastases MSI ont montré un développement métastatique moins prononcé à certains sites par rapport aux souris MSS. Le séquençage de l'exome complet (WXS) a révélé que la charge mutationnelle tumorale (mutations non-synonymes/megabase), les indels, ainsi que le MSIscore (pourcentage de microsatellites instables) étaient plus élevés dans les tumeurs MSI comparées aux MSS, mais ces différences n'expliquent pas l'écart de développement métastatique. Les analyses transcriptomiques ont mis en évidence que les tumeurs MSS expriment des programmes associés à la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT), tandis que les tumeurs primaires MSI et les tumeurs métastatiques MSI étaient respectivement enrichies en signatures prolifératives et immunitaires. Il est à noter que les tumeurs métastatiques MSI étaient spécifiquement enrichies d'une signature hybride EMT, un indicateur d'agressivité tumorale. Par ailleurs, la cytométrie spectrale a permis d'identifier des populations spécifiques de macrophages et de neutrophiles associés aux tumeurs MSI (TAMs-MSI et TANs-MSI) tant dans les tumeurs primaires que sur les sites métastatiques. Enfin, nous avons découvert que l'infiltration de TANs-MSI (mais pas de TAMs-MSI) au niveau des sites secondaires précédait le développement métastatique et pourrait contribuer à la formation d'une niche pré-métastatique spécifique au MSI.Conclusion : Nous avons établi un modèle de cancer métastatique MSI, reproduisant les caractéristiques principales de la maladie, telles qu'une accumulation de mutation et d'indels élévé, ainsi qu'un potentiel métastatique diminué. Nos résultats montrent que la progression métastatique dans ce modèle MSI est associée à une réduction de l'activité immunitaire à la tumeur primaire, et que les tumeurs métastatiques MSI présentent un enrichissement en signatures prolifératives et en signatures hybrides EMT, pouvant ainsi expliquer le mauvais pronostic observé après récidive chez les patients. De plus, ce modèle a mis en lumière des populations myéloïdes spécifiques aux tumeurs MSI ainsi qu'une niche pré-métastatique potentielle liée au MSI. Ce modèle constitue ainsi un outil précieux pour la recherche fondamentale et translationnelle sur le cancer métastatique MSI, tout en apportant de nouvelles perspectives sur les interactions entre le développement métastatique et le phénotype MSI.

Background: It is established that mismatch repair deficient (MMR-D), hypermutated and microsatellite instable (MSI) colorectal cancer (CRC) is less prone to metastasis, and has worse prognosis after recurrence, than microsatellite stable (MSS) CRC. The mechanisms behind both these phenomena are still elusive, mainly due to the lack of a good in vivo model of metastatic MSI cancer.Methods: We generated Msh2 knockouts in the luciferase expressing breast cancer cell line 4T1luc+. The MMR-D phenotype, an accumulation of point mutations genome-wide and insertion-deletion (indels) at microsatellite sites, was established by serial passages in vitro before orthotopic injection in the lower left mammary fat pad of BALB/c mice. Metastasis development was assessed through in vivo imaging of luciferase activity. Primary tumors of mice bearing metastasis, or not, were sequenced, and genomic and transcriptomic analysis were performed. Spectral flow cytometry of CD45+ cells was carried out on primary tumors, secondary site (lung tissue), bone marrow and blood before and after tumor engraftment, to characterize the different microenvironments.Results: A significant difference in metastasis occurrence was noted between the MSS and MSI tumor-bearing mice (100% vs 82.3%, p = 0.0456). Moreover, MSI metastatic mice exhibited less site-specific metastatic development compared to their MSS counterparts. Whole exome sequencing (WXS) revealed that tumor mutation burden (TMB, non-synonymous mutations/megabase), indels, and MSIscore (percentage of instable microsatellites) were elevated in the MSI tumors compared to MSS, but did not explain the difference in metastasis occurrence. Transcriptomic analyses demonstrated that MSS tumors express epithelial-mesenchymal transition (EMT) related programs, while MSI metastatic and MSI localized primary tumor were enriched in proliferative and immune related signatures, respectively. Interestingly, MSI metastatic tumor were uniquely enriched with a hybrid EMT signature, a marker of cancer aggressiveness. Furthermore, spectral cytometry uncovered MSI-specific populations of tumor-associated macrophages and neutrophils (MSI-TAMs and MSI-TANs) at the primary tumor and metastatic sites. Finally, we discovered that MSI-TANs (but not MSI-TAMs) infiltration at secondary site predate metastatic development, and may participate in the creation of an MSI-specific pre-metastatic niche.Conclusion: We successfully developed a model of MSI metastatic cancer, recapitulating the hallmarks of the disease, namely elevated TMB, indels and MSIscore, as well as decreased metastatic potential. We have shown that metastatic development in our MSI model is associated with lower immune activity at the primary tumor, and that MSI metastatic tumors are enriched in proliferative and hybrid EMT signatures, that may explain the poor prognosis after recurrence in patients. At last, this model unveiled MSI-specific tumor-associated myeloid populations, and a potential MSI pre-metastatic niche. We provide here a model for fundamental and translational research on MSI metastatic disease, and provide insights on the crosstalk between metastasis development and the MSI phenotype.