Approche combinée de microdissection laser et de spectrométrie de masse pour l'analyse protéomique de l'invasion tumorale.

par Mélanie Moreau

Projet de thèse en Biologie Cellulaire et Physiopathologie

Sous la direction de Frédéric Saltel.

Thèses en préparation à Bordeaux , dans le cadre de École doctorale Sciences de la vie et de la santé , en partenariat avec Bordeaux Research In Transational Oncology (laboratoire) depuis le 22-10-2019 .


  • Résumé

    La récurrence après traitement et la formation de métastases sont les deux principales causes de décès liés au cancer. Pour mieux comprendre ces deux processus distincts, nous utiliserons une méthodologie innovante développée au laboratoire. Récemment, nous avons établi une méthode de spectrométrie de masse pour l'analyse protéomique de cellules et de coupes de tissus inclus dans de la paraffine (FFPE) fixée au formol. Notre approche présente le principal avantage d'être compatible avec les biopsies, correspondant au matériel biologique actuellement disponible et utilisé à l'hôpital. Au cours de la thèse, le candidat étudiera i) les structures d'invasion in vitro et ii) l'invasion dans le cancer du foie. i) Dans une étude précédente, une approche combinant la microdissection laser et l'analyse par spectrométrie de masse a été utilisée pour définir le protéome de l'invadosome du modèle cellulaire NiH3T3-SrcY527. Cette approche a permis d'établir que la Reptine et la Pontine sont enrichies dans les invadosomes plus de 6 et 3 fois respectivement, par rapport au lysat cellulaire total. La depletion de la Reptin provoque une réorganisation complète du cytosquelette d'actine. Les cellules retrouvent une morphologie NIH-3T3 de type sauvage avec la présence de fibres de stress et l'absence d'invadosomes. Cette organisation reflète une perte d'activité de SrcY527F et un lien moléculaire avec Reptin. Nous avons émis l'hypothèse que Reptin est impliqué, via le complexe de chaperonnage R2TP, dans la formation et l'activité des invadosomes, y compris la modulation de l'activité de SrcY527F, par la stabilisation d'une protéine régulatrice de l'activation de Src. Le but de cette partie sera de mettre en évidence le mécanisme impliqué dans la formation spontanée des invadosomes in vitro. ii) En parallèle, pour identifier, capturer et analyser l'invasion tumorale directement dans les tissus humains, nous avons besoin d'un modèle permettant de détecter une invasion tumorale. Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est une tumeur très invasive et associée dans la plupart des cas à une cirrhose. De plus, le CHC est devenu une cause majeure de décès par cancer. Cette tumeur est un bon modèle en raison de la présence d'une capsule qui correspond à une barrière fibreuse entourant la tumeur. Ainsi, pour former des métastases intrahépatiques, les cellules de CHC doivent dégrader cette capsule. Par conséquent, il est facile de visualiser, localiser et capturer la zone d'invasion qui correspond à la partie de la capsule envahie. Le but de cette partie du projet sera de microdissecter des zones invasives dans les tissus de CHC et de réaliser une analyse par spectrométrie de masse sur ces échantillons. Le doctorant utilisera cette approche innovante pour identifier de nouveaux marqueurs d'invasion dans le CHC. Ces marqueurs seront confirmés in vivo et in vitro dans un second temps. À l'aide d'un modèle d'encapsulation 3D développé en laboratoire, nous confirmerons l'implication de ces marqueurs dans l'invasion. L'immunohistochimie sur une cohorte plus large de patients et de nouveaux modèles cellulaires seront mis en place pour mieux comprendre les voies moléculaires impliquées dans l'invasion tumorale.

  • Titre traduit

    A combined laser microdissection and mass spectrometry for proteomic analysis of tumor invasion.


  • Résumé

    Recurrence after treatment and metastasis are the two leading causes of cancer-related death. To better understand these two distinct processes, we will use an innovative methodology developed in the lab. Recently, we have established a mass spectrometry method for proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) cells and tissue sections. The main advantage of our approach is that it is compatible with biopsies, corresponding to the biological material currently available and used in hospitals. During the thesis, the candidate will study i) in vitro invasion structures and ii) invasion in liver cancer. i) In a previous study, a combined laser microdissection and mass spectrometry analysis approach was used to define the invadosome proteome of the NiH3T3-SrcY527 cell model. This approach established that Reptin and Pontin are enriched in the invadosomes more than 6- and 3-fold, respectively, relative to total cell lysate. The depletion of Reptin causes a complete reorganization of the actin cytoskeleton. The cells recover a wild-type NIH-3T3 morphology with the presence of stress fibers and the absence of invadosomes. This organization reflects a loss of SrcY527F activity and a molecular link to Reptin. We hypothesized that Reptin is involved, via the R2TP chaperone complex, in invadosome formation and activity, including modulation of SrcY527F activity, through stabilization of a Src activation regulatory protein. The aim of this section will be to highlight the mechanism involved in the spontaneous formation of invadosomes in vitro. ii) In parallel, in order to identify, capture and analyze tumor invasion directly in human tissues, we need a model to detect tumor invasion. Hepatocellular carcinoma (HCC) is a highly invasive tumor and associated in most cases with cirrhosis. In addition, HCC has become a major cause of cancer-related death. This tumor is a good model because of the presence of a capsule that corresponds to a fibrous barrier surrounding the tumor. Thus, to form intrahepatic metastases, HCC cells must degrade this capsule. Therefore, it is easy to visualize, localize and capture the invasion zone which corresponds to the invaded part of the capsule. The goal of this part of the project will be to microdissect invasive areas in HCC tissues and perform mass spectrometry analysis on these samples. The PhD student will use this innovative approach to identify new markers of invasion in HCC. These markers will be confirmed in vivo and in vitro in a second step. Using a 3D encapsulation model developed in the laboratory, we will confirm the involvement of these markers in invasion. Immunohistochemistry on a larger cohort of patients and new cellular models will be set up to better understand the molecular pathways involved in tumor invasion.