Le rôle de l'organisation 3D du génome dans la réponse transcriptionnelle aux stimuli externes et développementaux

The role of 3D genome organization in transcriptional response to external and developmental stimuli

• Auteur / Autrice : Michael-Florian Szalay
• Direction : Giacomo Cavalli
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Inscription en doctorat le ; Soutenance le 05/12/2023
• Etablissement(s) : Université de Montpellier (2022-....)
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : IGH - Institut de Génétique Humaine
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Chromatine et biologie cellulaire
• Jury : Président / Présidente : Magda Bienko
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Giacomo Cavalli, Luca Giorgetti, Daan Noordermeer, Charlene Boumendil
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Luca Giorgetti, Daan Noordermeer

Mots clés

Mots clés libres

Organisation du génome 3D

Différenciation cellulaire

Choc thermique

3D genome organisation

Cell differentiation

Heat shock

Résumé

Le contrôle spatial et temporel de l'expression des gènes est essentiel au développement et à l'adaptation aux stimuli externes. L’organisation du génome chez les mammifères décrit la formation de compartiments chromosomiques, de domaines d'interactions chromatiniens appelés TADs et de boucles chromatiniennes. Ces boucles permettent de créer des interactions fonctionnelles entre des éléments génomiques qui régulent l’expression génique comme entre les promoteurs et les enhancers, et sont principalement formées par un mécanisme d'extrusion médié par la cohésine. Ces dernières années, de nombreuses études ont révélé l'importance de l'organisation du génome dans la régulation de nombreuses fonctions biologiques essentielles. Au cours de ma thèse, je me suis attaché à mieux comprendre l’impact de différents types de stress sur l’architecture du génome et le rôle de cette dernière dans le rétablissement du profil transcriptionnel. Je me suis également intéressé à mieux comprendre les liens dynamiques et interdépendants entre la transcription des gènes et l’organisation 3D du génome au cours du développement précoce. Suite à un choc thermique, les cellules activent une réponse rapide, transitoire et conservée au cours de l'évolution entrainant des changements transcriptionnels massifs sans modifier l'organisation 3D du génome. Afin d’étudier la réponse des cellules souches à différents types de stress, j'ai développé différentes approches notamment le séquençage de l'ARN naissant, le Micro-C : méthode de cartographie à haute résolution de la conformation de la chromatine et le système de dégradation AID-Auxin pour dépléter rapidement les facteurs d'extrusion de boucles. J’ai ainsi pu décrire les conséquences d'un choc thermique (HS) sur l'organisation 3D du génome, mais aussi étudier le rôle que jouent les facteurs CTCF et cohésine dans l'activation de gènes spécifiques du HS et dans la récupération après le stress. Nous avons pu observer que tous les niveaux d'organisation du génome, depuis les compartiments A/B jusqu'aux boucles enhancer-promoteur, restent stables et inchangés au cours d'un HS. Cela suggère que les communications entre les promoteurs et les enhancers sont probablement pré-établies et que la régulation des gènes ne modifie pas l'organisation 3D. Les cellules dépourvues de facteurs d'extrusion de boucles peuvent également changer rapidement leur programme de transcription. De manière plus surprenante, nous avons également décrit que dans toutes les conditions de déplétion, les cellules parviennent à se remettre entièrement des perturbations. Nous avons conclu que les cellules souches embryonnaires sont extrêmement résilientes et peuvent revenir dans leur état initial à la fin des perturbations cellulaires. Les résultats de ce projet et des études récentes nous ont amenés à étudier l'importance de l'organisation du génome au cours du développement précoce. Nous avons donc utilisé des gastruloïdes, systèmes d’assemblage cellulaire, qui peuvent mimer le développement embryonnaire précoce in vitro. Après avoir différencié en gastruloïdes une lignée de cellules ES déplétée en CTCF de façon constante ou transitoire, j’ai réalisé des analyses RNA-seq et des immunomarquages à différents stades de différenciation. Les gastruloïdes dépourvus de CTCF développe un profil transcriptionnel associé au développement précoce mais accompagné d’apoptose. La déplétion transitoire de CTCF se comporte de manière similaire mais avec une meilleure survie et un retour à leur état transcriptionnel. Ces résultats suggèrent que la déplétion de CTCF modifie l'organisation spatiale et temporelle des interactions chromatiniennes. J’ai pu démontrer qu'au cours du développement, l'organisation du génome peut aider à canaliser les interactions génomiques 3D. Le repliement dynamique du génome en 3D dans le noyau permet d'équilibrer les interactions probabilistes entre l'enhancer et le promoteur, qui sont importantes pour un développement correct.

Spatial and temporal control of gene expression is essential for development and for the response to external stimuli. The control of gene expression is multifaceted, and one side of this control is 3D genome organisation. Well-studied levels of genome organisation in mammals are chromosome compartments, chromatin interaction domains and chromatin loops. These loops are present as functional interactions between various genomic elements, for example, enhancers and promoters, and are primarily formed by cohesin-mediated loop extrusion. In recent years, numerous studies have revealed the importance of genome organisation for the regulation of many essential biological functions. However, it is unclear how different stressors affect genome organisation and how 3D organisation can contribute to cells recover their transcriptional state after a perturbation. Moreover, it is not fully known what are the dynamics and interdependencies between transcription and 3D genome organisation during early development? These are the core questions of my doctoral thesis. Challenged with heat, cells activate an evolutionarily conserved heat shock (HS) response, a rapid and transient gene expression state. Even though these conditions include massive transcriptional changes, activation of several hundred, and repression of several thousand genes, it appears that the 3D genome organisation is not affected to the same large extent. To study the response of ESCs to heat stress, I introduced new methods in the lab, including nascent RNA-sequencing and Micro-C, a high-resolution chromatin conformation mapping. During my thesis, we used the AID-Auxin degradation system to rapidly deplete loop extrusion factors. These methods allowed me not only to describe the consequences of a HS on 3D genome organisation but also to investigate which role CTCF and cohesin play in the activation of specific HS genes and the recovery from the stress. We could observe that all levels of genome organisation, from A/B compartments to enhancer-promoter loops, remain largely unchanged during a HS. This suggests that the communications between promoters and enhancers are likely pre-established or independent of 3D chromatin conformation. Further, repressed genes do not greatly change 3D organisation. Cells depleted of loop-extrusion factors can also quickly switch their transcription program. More surprisingly, we found that in all depletion conditions, cells managed to recover from perturbations. We concluded that, in mESC, gene expression and 3D genome organisation programs are extremely resilient and can restore their initial conditions at the end of cellular perturbations. Results from this project and recent studies lead us to investigate the importance of genome organisation during early development. To this aim, we used gastruloids, a recently developed cell assembly system which recapitulates cell divisions and differentiation processes that characterize gastrulation in vitro. I was able to differentiate a CTCF depletion mESC cell line into gastruloids. We performed RNA-seq and immunostainings at different stages in combination with a constant and transient depletion. CTCF-depleted gastruloids were able to activate the developmental transcription program. Nevertheless, the program was defective and gastruloids additionally showed a strong apoptotic phenotype. The transient depletion behaved similarly to the constant condition. However, cells that re-expressed CTCF survived and partially recovered their transcriptional state. We hypothesized that depletion of CTCF changes the spatial and temporal organisation of chromatin interactions. Altogether, my PhD thesis demonstrates that during development, genome organisation can help to canalise 3D genome interactions. The dynamic folding of the genome within the 3D space of the nucleus balances probabilistic enhancer-promoter interactions, which are important for proper development.