Auteur / Autrice : | Alexandre Bouyssou | |
Direction : | Jean-Philippe Pin, Philippe Rondard | |
Type : | Projet de thèse | |
Discipline(s) : | Biologie Santé | |
Date : | Inscription en doctorat le | Soutenance le 13/12/2022 |
Etablissement(s) : | Université de Montpellier (2022-….) | |
Ecole(s) doctorale(s) : | Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé (Montpellier ; Ecole Doctorale ; 2015-....) | |
Partenaire(s) de recherche : | Laboratoire : IGF - Institut de Génomique Fonctionnelle | |
Equipe de recherche : NEURORÉCEPTEURS, DYNAMIQUE ET FONCTIONS | ||
Jury : | Président / Présidente : Jean-Louis BANèRES | |
Examinateurs / Examinatrices : Jean-Philippe Pin, Andrew Kruse, Martin Lohse, Julien Hanson, Philippe Rondard, Eric Trinquet, Patrick Barth | ||
Rapporteurs / Rapporteuses : Andrew Kruse, Martin Lohse |
Mots clés
Résumé
Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) représentent la plus grande famille de récepteurs membranaires chez lhomme, et sont la cible denviron 30% des médicaments. Diverses voies de signalisation issues de différentes familles de protéines G trimériques (Gs, Gq/11, Gi/o et G12/13) sont activées par les RCPG. Etant donné quun RCPG peut activer plusieurs protéines G, il est important de comprendre comment certains ligands peuvent favoriser lactivation dune ou plusieurs protéines G au détriment des autres (ligands biaisés). En effet, ces ligands biaisés ont un potentiel thérapeutique important. Il est donc nécessaire de développer des tests dactivation spécifiques pour chacune des familles de protéines G permettant de déterminer la signature des ligands dans un contexte au plus proche de la physiologie. Lobjectif de ma thèse a été de développer de tels essais innovants en utilisant la technologie HTRF® compatible avec létude en cellules des RCPG et protéines G endogènes. Dans ce cadre, mon projet de thèse sest articulé autour de trois axes principaux. Dans un premier temps, jai participé au développement dun test pour mesurer lactivation des protéines Gi/o natives à partir préparations membranaires surexprimant des RCPG dintérêt. Ce test repose sur lutilisation dun peptide et danticorps spécifiques de certaines conformations adoptées par la protéine Gαi/o lors de son cycle dactivation. Ces outils de détection ont été couplés à des fluorophores compatibles avec la technologie HTRF®. De manière intéressante, nous avons montré que mesurer laccumulation de la conformation Gαi-vide à partir de la conformation Gαi-GTPγS, constitue une approche robuste et originale pour mesurer lactivation de cette famille de protéines G. Létude pharmacologique des récepteurs δ, μ et κ-opioïdes, impliqués dans les mécanismes de perception de la douleur, a permis de valider notre approche. Dans un second temps, jai mis en place un test cellulaire innovant qui vise à mesurer lactivation des protéines Gi/o endogènes à travers lutilisation de GTP fluorescent et dun anticorps fluorescent spécifique des protéines Gαi/o. Ce test HTRF® est basé sur lincorporation du GTP fluorescent dans les protéines Gαi/o activées. Létude du récepteur μ-opioïde, à partir de cellules lexprimant de manière stable, a permis de montrer quil est possible de mesurer lactivation des protéines Gi/o endogènes, de manière directe, dans les cellules. Cette méthode sensible a également été utilisée pour mesurer lactivation des protéines Gi/o par un récepteur endogène. Enfin, jai développé des anticorps spécifiques des sous-unités Gβγ que jai associé à des anticorps spécifiques des sous-unités Gαi/o, dans le but de mesurer lactivation protéine Gi/o à travers le réarrangement entre les sous-unités Gα et Gβγ. Cette dernière étude a également été réalisée en HTRF® à partir de cellules exprimant le récepteur μ-opioïde. De façon surprenante, lutilisation de GTPγS dans notre essai a permis dobserver son relargage de la sous-unité Gα suite à lactivation du récepteur et la formation du complexe de haute affinité agoniste-RCPG-Gαvideβγ. Cette nouvelle stratégie de mesure de lactivation des protéines G, permet de mesurer lactivation des protéines Gi/o dans les cellules à partir des sous-unités Gαi et Gβ natives, et dinvestiguer le réarrangement ou la dissociation des sous-unités Gα et Gβγ de la protéine G. En conclusion, les résultats obtenus ouvrent la voie au développement de tests HTRF® pour les autres familles de protéines G en suivant les mêmes stratégies. A plus long terme, nous espérons que ces nouveaux essais innovants permettront une meilleure compréhension de lactivité des RCPG et des protéines G pour le développement de molécules thérapeutiques plus efficaces, plus spécifiques, et induisant moins deffets secondaires.