Thèse en cours

Développement d'essais HTRF® innovants pour détecter l'activation des protéines G natives dans un modèle cellulaire.
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Triangle exclamation pleinLa soutenance a eu lieu le 13/12/2022. Le document qui a justifié du diplôme est en cours de traitement par l'établissement de soutenance.
Auteur / Autrice : Alexandre Bouyssou
Direction : Jean-Philippe PinPhilippe Rondard
Type : Projet de thèse
Discipline(s) : Biologie Santé
Date : Inscription en doctorat le
Soutenance le 13/12/2022
Etablissement(s) : Université de Montpellier (2022-….)
Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé (Montpellier ; Ecole Doctorale ; 2015-....)
Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : IGF - Institut de Génomique Fonctionnelle
Equipe de recherche : NEURORÉCEPTEURS, DYNAMIQUE ET FONCTIONS
Jury : Président / Présidente : Jean-Louis BANèRES
Examinateurs / Examinatrices : Jean-Philippe Pin, Andrew Kruse, Martin Lohse, Julien Hanson, Philippe Rondard, Eric Trinquet, Patrick Barth
Rapporteurs / Rapporteuses : Andrew Kruse, Martin Lohse

Résumé

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Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) représentent la plus grande famille de récepteurs membranaires chez l’homme, et sont la cible d’environ 30% des médicaments. Diverses voies de signalisation issues de différentes familles de protéines G trimériques (Gs, Gq/11, Gi/o et G12/13) sont activées par les RCPG. Etant donné qu’un RCPG peut activer plusieurs protéines G, il est important de comprendre comment certains ligands peuvent favoriser l’activation d’une ou plusieurs protéines G au détriment des autres (ligands biaisés). En effet, ces ligands biaisés ont un potentiel thérapeutique important. Il est donc nécessaire de développer des tests d’activation spécifiques pour chacune des familles de protéines G permettant de déterminer la signature des ligands dans un contexte au plus proche de la physiologie. L’objectif de ma thèse a été de développer de tels essais innovants en utilisant la technologie HTRF® compatible avec l’étude en cellules des RCPG et protéines G endogènes. Dans ce cadre, mon projet de thèse s’est articulé autour de trois axes principaux. Dans un premier temps, j’ai participé au développement d’un test pour mesurer l’activation des protéines Gi/o natives à partir préparations membranaires surexprimant des RCPG d’intérêt. Ce test repose sur l’utilisation d’un peptide et d’anticorps spécifiques de certaines conformations adoptées par la protéine Gαi/o lors de son cycle d’activation. Ces outils de détection ont été couplés à des fluorophores compatibles avec la technologie HTRF®. De manière intéressante, nous avons montré que mesurer l’accumulation de la conformation Gαi-vide à partir de la conformation Gαi-GTPγS, constitue une approche robuste et originale pour mesurer l’activation de cette famille de protéines G. L’étude pharmacologique des récepteurs δ, μ et κ-opioïdes, impliqués dans les mécanismes de perception de la douleur, a permis de valider notre approche. Dans un second temps, j’ai mis en place un test cellulaire innovant qui vise à mesurer l’activation des protéines Gi/o endogènes à travers l’utilisation de GTP fluorescent et d’un anticorps fluorescent spécifique des protéines Gαi/o. Ce test HTRF® est basé sur l’incorporation du GTP fluorescent dans les protéines Gαi/o activées. L’étude du récepteur μ-opioïde, à partir de cellules l’exprimant de manière stable, a permis de montrer qu’il est possible de mesurer l’activation des protéines Gi/o endogènes, de manière directe, dans les cellules. Cette méthode sensible a également été utilisée pour mesurer l’activation des protéines Gi/o par un récepteur endogène. Enfin, j’ai développé des anticorps spécifiques des sous-unités Gβγ que j’ai associé à des anticorps spécifiques des sous-unités Gαi/o, dans le but de mesurer l’activation protéine Gi/o à travers le réarrangement entre les sous-unités Gα et Gβγ. Cette dernière étude a également été réalisée en HTRF® à partir de cellules exprimant le récepteur μ-opioïde. De façon surprenante, l’utilisation de GTPγS dans notre essai a permis d’observer son relargage de la sous-unité Gα suite à l’activation du récepteur et la formation du complexe de haute affinité agoniste-RCPG-Gαvideβγ. Cette nouvelle stratégie de mesure de l’activation des protéines G, permet de mesurer l’activation des protéines Gi/o dans les cellules à partir des sous-unités Gαi et Gβ natives, et d’investiguer le réarrangement ou la dissociation des sous-unités Gα et Gβγ de la protéine G. En conclusion, les résultats obtenus ouvrent la voie au développement de tests HTRF® pour les autres familles de protéines G en suivant les mêmes stratégies. A plus long terme, nous espérons que ces nouveaux essais innovants permettront une meilleure compréhension de l’activité des RCPG et des protéines G pour le développement de molécules thérapeutiques plus efficaces, plus spécifiques, et induisant moins d’effets secondaires.