Etude de la variabilité virale des Pestivirus et développement d’un test de pureté par la technologie NGS

Study of the viral variability of Pestivirus and development of a purity test using NGS technology

• Auteur / Autrice : Rémi La Polla
• Direction : Catherine Legras, Blandine de Saint-Vis
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Virologie et biologie moléculaire
• Date : Soutenance le 02/02/2022
• Etablissement(s) : Lyon
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Evolution Ecosystèmes Microbiologie Modélisation (Lyon ; 1999-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Université Claude Bernard (Lyon ; 1971-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire d'écologie Microbienne (Lyon)
• Jury : Président / Présidente : Branka Horvat
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Catherine Legras, Blandine de Saint-Vis, Gilles Meyer, Étienne Thiry, Marc Eloit, Michèle Ottmann, Carine Logvinoff
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Gilles Meyer, Étienne Thiry

Mots clés

Mots clés contrôlés

Tests

Cultures primaires

Conception

Vaccins

Pestivirus

Mots clés libres

Pestivirus

Cellules primaires

Wnt

Réplication virale

NGS

Test de pureté

Pestivirus

Primary cells

Wnt

Viral replication

NGS

Purity testing

Résumé

Mes travaux de thèse ont porté à la fois sur l’étude de la variabilité virale des Pestivirus et sur le développement d’un test de pureté par NGS lors de la fabrication de vaccins. Les Pestivirus peuvent être caractérisés, selon leur capacité à induire des effets cytopathiques en culture, en deux biotypes : cytopathogéniques (cp) et non cytopathogéniques (ncp) et nous nous sommes intéressés à rechercher l’existence de marqueurs cellulaires liés à ces deux biotypes. Pour répondre à cette question, une étude de comparaison du transcriptome a été menée après infection de cellules primaires par une souche BVDV-1 cp et ncp. L’étude a mis en évidence différentes voies de signalisation induites après infection en fonction du biotype. Nous avons notamment démontré un rôle de la voie Wnt dans la réplication virale et des essais d’inhibition ont permis de montrer à la fois une diminution de la production virale et un retard de l’apparition des effets cytopathiques ouvrant ainsi l’investigation de nouvelles cibles thérapeutiques. Concernant le développement par NGS d’un test de pureté lors de la fabrication de vaccin, la réglementation Européenne impose de contrôler l’absence de contaminants dont les Pestivirus. A ce jour, les tests réglementaires reposent sur des tests in vitro et in vivo mais la distribution mondiale des Pestivirus ainsi que le désir de réduire l’utilisation d’animaux nous obligent à évaluer de nouvelles méthodes. Dans cette optique, l’utilisation du NGS ciblé contre les Pestivirus par enrichissement a été évaluée afin de proposer une alternative innovante qui permettra de détecter l’ensemble des Pestivirus et de répondre aux problématiques des tests actuels.

My thesis work focused both on the study of the viral variability of Pestivirus and on the development of a purity test by NGS during the manufacture of vaccines. Pestivirus can be characterized, according to their ability to induce cytopathic effects in culture, in two biotypes: cytopathogenic (cp) and non-cytopathogenic (ncp) and we were interested in looking for the existence of cell markers linked to these two biotypes. To answer this question, a comparison study of the transcriptome was carried out after infection of primary cells with a strain BVDV-1 cp and ncp. The study revealed different signaling pathways induced after infection depending on the biotype. In particular, we have demonstrated a role for the Wnt pathway in viral replication and inhibition tests have shown both a decrease in viral production and a delay in the appearance of cytopathic effects, thus opening the investigation of new therapeutic targets. Regarding the development by NGS of a purity test during vaccine manufacture, European regulations require that the absence of contaminants, including Pestivirus, be checked. To date, regulatory testing has relied on in vitro and in vivo testing, but the worldwide distribution of Pestivirus and the desire to reduce the use of animals are forcing us to evaluate new methods. With this in mind, the use of NGS targeted against Pestivirus by enrichment has been evaluated in order to propose an innovative alternative which will make it possible to detect all Pestivirus and to respond to the problems of current tests.