Rôle du complexe FIGNL1-FLIP lors de la recombinaison méiotique de souris.

Role of FIGNL1-FLIP complex during mouse meiotic recombination

• Auteur / Autrice : Akbar Zainu
• Direction : Frédéric Baudat
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Inscription en doctorat le ; Soutenance le 05/12/2022
• Etablissement(s) : Université de Montpellier (2022-….)
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé (Montpellier ; Ecole Doctorale ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : IGH - Institut de Génétique Humaine
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Méiose et recombinaison
• Jury : Président / Présidente : Laurent Maloisel
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Frédéric Baudat, Maria Jasin, Emmanuelle Martini, Raphaël Mercier
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Emmanuelle Martini, Raphaël Mercier

Mots clés

Mots clés libres

Recombinaison homologue

Méiose

Fertilité

Stabilité du génome

Souris

Homologous recombination

Meiosis

Fertility

Genome stability

Mouse

Résumé

La recombinaison homologue (RH) est un mécanisme de réparation de l'ADN fidèle qui permet de réparer les cassures double brin de l'ADN (CDB) en copiant une séquence homologue intacte. Elle joue un rôle essentiel lors de la méiose, en assurant la ségrégation des chromosomes maternels et paternels et permet d’augmenter la diversité génétique. La recombinaison méiotique commence par la formation programmée de CDBs par la protéine SPO11 en début de prophase. Les extrémités des CDB sont ensuite réséquées, générant des extrémités d'ADN simple brin (ADNsb) 3' débordantes qui sont protégées par la protéine RPA. RPA est remplacée sur l’ADNsb par les protéines d'échange de brins RAD51 (ubiquitaire) et DMC1 (spécifique à la méiose). Avec l’ADNsb, RAD51 et/ou DMC1 forment un filament nucléo-protéique qui porte les activités de recherche d'homologie et d'invasion de brin vers un ADN double-brin intact. Cette étape, l’étape clé de la recombinaison méiotique, est étroitement régulée par l'équilibre entre des régulateurs positifs et négatifs de la formation du filament RAD51/DMC1-ADNsb et de la réaction d'invasion de brin qui s'ensuit. Le complexe SWS1-SWSAP1 (complexe Shu) est un des facteurs qui stabilisent le filament RAD51/DMC1. Des études récentes chez Arabidopsis et des cellules humaines ont permis d’identifier le complexe conservé FIGNL1-FLIP comme un nouveau régulateur négatif de RAD51 et DMC1. L’objectif de ma thèse a été de déterminer le rôle fonctionnel de FIGNL1 et FLIP lors de la recombinaison méiotique chez la souris, en générant et caractérisant des modèles murins d’inactivation conditionnelle (KO conditionnels), spécifiques de la lignée germinale mâle, des gènes Fignl1 et Flip (Fignl1 cKO, Flip cKO). J’ai montré que ces deux gènes sont essentiels à la fertilité : leur absence entraine un arrêt et une élimination des spermatocytes avant les divisions méiotiques. Fignl1 cKO et Flip cKO présentent des défauts de synapse des chromosomes homologues et de réparation des CDB méiotiques. En l'absence de FIGNL1 ou de FLIP, les CDB méiotiques sont formées et réséquées mais leur réparation par RH n’est pas achevée. Dans les souris WT, RAD51 et DMC1 forment des foyers transitoires sur les chromosomes méiotiques, visualisant les intermédiaires de recombinaison. Dans les spermatocytes Fignl1 cKO et Flip cKO au contraire, RAD51 et DMC1 s’accumulent en plus grand nombre, et forment également des structures ressemblant à des fibres. MSH4, qui est un marqueur d’une étape de RH postérieure à l’échange de brin catalysé par DMC1 et RAD51, forme normalement des foyers sur les chromosomes méiotiques après DMC1 et RAD51. Le nombre de foyers MSH4 est fortement réduit dans les mutants, indiquant un défaut de progression dans le processus de RH. Les protéines DMC1 et RAD51, bien qu’elles soient recrutées sur les chromosomes, pourraient donc ne pas catalyser efficacement la réaction d’échange de brin en l’absence de FIGNL1 ou FLIP. En absence de la protéine SPO11 fonctionnelle, les CDBs méiotiques ne sont pas formées et RAD51 et DMC1 ne sont pas recrutées sur les chromosomes. Cependant, dans les doubles mutants Spo11 Fignl1 cKO et Spo11 Flip cKO, RAD51 et DMC1 s’accumulent sur les chromosomes comme dans les simple mutants Fignl1 cKO et Flip cKO. En l'absence de FIGNL1 ou FLIP, RAD51 et DMC1 sont donc recrutées sur le chromosome méiotique de manière indépendante des CDB. Le complexe FIGNL1-FLIP pourrait restreindre ou empêcher l’association stable de DMC1 et RAD51 à l’ADN double brin intact, et également à des protéines de structures du chromosome méiotique. Mes travaux démontrent que le complexe conservé FIGNL1-FLIP est un régulateur essentiel de la RH méiotique qui limite l’accumulation de RAD51 et DMC1 sur les chromosomes méiotiques. Il joue également un rôle, direct ou indirect, dans le processus normal de la recombinaison méiotique, traduit par un défaut de progression vers les étapes tardives de la RH dans les spermatocytes Fignl1 cKO et Flip cKO.

Homologous recombination (HR) is a faithful DNA repair mechanism that repairs DNA double-strand breaks (DSB) in a template-dependent manner. HR plays a critical role in meiosis for ensuring proper chromosome segregation and in promoting genetic diversity. Meiotic recombination initiates with the formation of programmed double-strand breaks (DSB) by SPO11 in early meiotic prophase. The DSB ends are then resected and resulting 3’ single-stranded DNA (ssDNA) tails are protected by RPA. Strand exchange proteins RAD51 (ubiquitous) and DMC1 (meiosis specific) replace RPA on ssDNA. RAD51and/or DMC1 bound on ssDNA forms a nucleoprotein filament that carries out homology search and the strand invasion of an intact duplex DNA. This strand invasion step is central to meiotic recombination and is tightly regulated by the balance between several proteins that promote or oppose the loading and stable assembly of RAD51/DMC1 on ssDNA and the subsequent reaction of strand invasion. The SWS1-SWSAP1 complex (Shu complex) is one of these factors that stabilize the RAD51/DMC1 filament. Recent studies in Arabidopsis and human cells proposed FIGNL1-FLIP as a novel, conserved negative regulator of RAD51 and DMC1. The goal of my PhD project was to characterize the functional role of FIGNL1 and FLIP during meiotic recombination in mice, by generating and characterizing mouse models of male germline-specific, conditional inactivation (conditional knockout) of Fignl1 and Flip genes (Fignl1 cKO, Flip cKO). I showed that these two genes are essential for fertility: their absence causes spermatocytes to stop and be eliminated before meiotic divisions. Fignl1cKO and FlipcKO show similar defects in homologous chromosome synapsis and meiotic DSB repair. In the absence of FIGNL1 or FLIP, DSBs are formed and resected (RPA foci are present on chromosome axes), but their repair by HR does not succeed. In WT mice, RAD51 and DMC1 form transient foci on meiotic chromosomes, visualizing recombination intermediates. In Fignl1 cKO and Flip cKO spermatocytes on the contrary, RAD51 and DMC1 foci accumulate in greater numbers, and they also form fiber-like structures never observed in WT. MSH4, which is a marker of an HR step subsequent to strand exchange reaction catalyzed by DMC1 with RAD51, normally forms foci on meiotic chromosomes after DMC1 and RAD51. The number of MSH4 foci is greatly reduced in both mutants, indicating a lack of progression in the HR process. The DMC1 and RAD51 proteins, although they are recruited to the chromosomes, may therefore not effectively catalyze the strand exchange reaction in the absence of FIGNL1 or FLIP. In the absence of the functional SPO11 protein, meiotic DSBs are not formed and RAD51 and DMC1 are not recruited to the chromosomes. However, in Spo11 Fignl1 cKO and Spo11 Flip cKO double mutants, RAD51 and DMC1 accumulate on the chromosomes as much as in Fignl1 cKO and Flip cKO single mutants. In the absence of FIGNL1 or FLIP, RAD51 and DMC1 are therefore recruited to the meiotic chromosome independently of DSBs. The FIGNL1-FLIP complex might restrict or prevent the stable association of DMC1 and RAD51 with intact double-stranded DNA, and also with structural proteins of the meiotic chromosome. Altogether, my work demonstrates that the conserved FIGNL1-FLIP complex is an essential regulator of meiotic HR that limits the accumulation of RAD51 and DMC1 on meiotic chromosomes. It plays a role, direct or indirect, in the normal process of meiotic recombination, reflected by a defect in progression towards the late stages of HR in Fignl1 cKO and Flip cKO spermatocytes.