Caractérisation structurale in situ des complexes de réplication du virus Chikungunya par cryo-tomographie électronique

In situ structural characterization of Chikungunya virus replication complexes by electron cryo-tomography

• Auteur / Autrice : Justine Girard
• Direction : Patrick Bron, Laurence Briant
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Inscription en doctorat le ; Soutenance le 16/12/2022
• Etablissement(s) : Université de Montpellier (2022-….)
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé (Montpellier ; Ecole Doctorale ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : CBS - Centre de Biologie Structurale
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Biologie struturale multi-échelles (BSME)
• Jury : Président / Présidente : Pierre-Yves Lozach
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Patrick Bron, Laurence Briant-longuet, Juan Reguera, Yannick Simonin, Félix Rey, Philippe Roingeard
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Félix Rey, Philippe Roingeard

Mots clés

Mots clés libres

Chikungunya

Réplication

Microscopie

Chikungunya

Replication

Microscopy

Résumé

Le virus Chikungunya (CHIKV) est un pathogène transmis par les moustiques de la famille Aedes pouvant provoquer une infection sévère chez l'Homme. Cette dernière décennie, une explosion de cas a été rapportée dans le monde entier, favorisée par le réchauffement climatique qui engendre une présence accrue du moustique dans les régions tempérées, faisant du CHIKV un problème de santé publique en l'absence de thérapie antivirale efficace. Le génome du CHIKV est constitué d'un ARN simple brin de polarité positive de 11,8 kb, avec une coiffe à son extrémité 5’ et une queue polyadénylée 3’, et code pour deux polyprotéines. Ces précurseurs sont clivés en quatre protéines non structurales (nsP1-4), et cinq protéines structurales (la protéine de capside (CP) et les glycoprotéines d’enveloppe (E3, E2, E1, 6k, et TF). Les Alphavirus, dont CHIKV, sont connus pour leurs capacités à remodeler la membrane cellulaire et engendrer notamment des déformations de type filopodes. De plus, comme tous les virus à simple brin d'ARN positif, la réplication virale se déroule dans des compartiments isolés de l’environnement cellulaire, appelés organelles de réplication (ORs), qui restent étroitement reliés à la cellule. Cette stratégie de réplication permet au virus de se répliquer en échappant aux mécanismes de dégradation des ARN et autres senseurs cellulaires de l’immunité innée. Dans les cellules infectées par CHIKV, ces ORs se forment au niveau de la membrane plasmique, où les protéines non-structurales de CHIKV et l'ARN viral forment ensemble le complexe de réplication (CR). La mise en place des CR est orchestrée par la protéine virale nsP1 et des récents travaux ont proposé des modèles préliminaires de leurs assemblages. Dans ce contexte, nous avons étudié l'architecture tridimensionnelle des ORs de CHIKV in-situ par cryo-tomographie électronique afin de confirmer les études précédentes, pour la première fois, en conditions infectieuses. L’identification exacte de ces acteurs de la réplication virale pourrait apporter de nouvelles cibles thérapeutiques. Nous avons dans un premier temps déterminé les conditions expérimentales permettant d’observer et de confirmer la localisation des ORs en cellules humaines par microscopie confocale et électronique (ME). Par la suite, l’analyse de cellules infectées par cryo-ME nous a permis de visualiser à la fois les ORs, les particules virales de CHIKV, mais aussi les régions cytoplasmiques adjacentes. Ces différentes études ont mis en évidence que les ORs sont préférentiellement à la membrane plasmique des corps cellulaires, mais aussi au niveau de structures de type filopodes. La formation des RO s’est révélée être très dynamique, avec plusieurs degrés de maturation et où différents facteurs cellulaires et/ou viraux ont semblés être impliqués. L’analyse tomographique ORs a permis de mettre en évidence la présence d’une base protéique présente, semblant assurer une connexion entre les ORs et le cytoplasme. Nos résultats démontrent aussi que contrairement aux postulats de base, les ORs peuvent être internés dans des vacuoles cytopathiques de type I et II (CPV-I et -II). De plus, et de façon importante, des approches de sommation de sous-volumes de cryo-tomogrammes ont permis de caractériser la connexion entre les ORs et la cellule hôte, confirmant ainsi les modèles précédemment publiés qui proposaient une organisation en anneau de la protéine virale nsP1. Ces résultats offrent donc une meilleure compréhension de l'agencement moléculaire du CR et nous permettent de proposer un modèle fonctionnel reliant réplication virale et modifications membranaires de la cellule hôte. Par conséquent, nos travaux apportent de nombreuses informations quant au déroulement de la réplication virale du CHIKV, et permettent de visualiser pour la première fois en contexte infectieux des structures et étapes essentielles à la réplication virale laissant désormais place à une meilleure compréhension du cycle viral du CHIKV.

Chikungunya virus (CHIKV) is a human pathogen transmitted by mosquito bites from the Aedes family, which can lead to severe disease. In the last ten years, a dramatic increase in the number of cases was observed all over the world, driven by global warming, increasing the presence of its mosquito vector in temperate regions. In the absence of effective treatments, CHIKV is becoming an important public health issue. CHIKV possesses a 5' capped and 3' polyadenylated positive single-stranded genome ((+) ss RNA) of 11.8kb that codes for two polyproteins from two ORFs. The polyprotein precursors are cleaved into four non-structural proteins (nsP1-4) and six structural proteins, a capsid (CP) protein and five surface glycoproteins (E3, E2, E1, 6k, and TF). Alphaviruses such as CHIKV are known to be able to remodel cellular membranes to favor viral replication, and filopodia-like structures are commonly observed upon infection. Importantly, similarly to other (+) ss RNA viruses, CHIKV replication takes place in viral-induced compartments named replications organelles (ROs). It is assumed that these ROs provide a favorable environment for viral genome replication but also help to avoid the cellular RNA degradation machinery and innate immune detection. In CHIKV-infected cells, ROs are readily detected at the plasma membrane (PM), where CHIKV nsPs and its viral genome will form a replication complex (RC). Based on results obtained for similar viruses and recent publications using purified proteins, it was proposed that nsP1 is driving the formation of RC. However, there is to date, no published validation of the different RC model formations obtained from infected cells. In this regard, we therefore aimed to validate the different models by studying the tridimensional architecture of ROs directly from HEK293T cells infected by CHIKV using cryo-electron tomography (cryo-ET) approaches. The identification of the different viral and cellular partners involved in CHIKV replication could lead to the development of new therapeutic targets. In this work, we were able to determine the appropriate infection conditions allowing us to observe and confirm the presence of RO, first by confocal and electron microscopy (EM). Our work, like others, was also able to demonstrate the presence of filopodia-like structures upon infection, where, for the first time, it was possible to show that ROs and viral particles (VPs) coexist. Cryo-ET analyses further validate our previous observations and help us shed light on an unexpected diversity of ROs suggesting that their formation and interaction with the near environment is a highly dynamic process. Importantly, ROs observed in our tomograms all showed the presence of a 'foot' at their neck. Sub-tomogram averaging methods demonstrated that this platform is formed of nsP1 proteins that assemble into a dodecameric ring to form a pore that could control the entry and exit of cellular and/or viral factors, thus validating previous models that suggest that nsP1 oligomerizes into a ring, located at the neck of the ROs. These results lead us to propose a model linking viral replication and viral-induced cellular deformations. Overall, our results shed light on the dynamic process of CHIKV replication by providing new structural insights into CHIKV RC and ROs formation, in an infectious context.