Les encéphalopathies épileptiques développementales en tant que synaptopathies - étude du rôle des récepteurs NMDA dans l'étiologie de la maladie

Developmental and epileptic encephalopathies as synaptopathies - assessment of the role of NMDA receptors in the etiopathogenesis of disease

• Auteur / Autrice : Roza Szlendak
• Direction : Julie Perroy, Dorota Hoffman-zacharska
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Inscription en doctorat le ; Soutenance le 11/05/2023
• Etablissement(s) : Université de Montpellier (2022-....) en cotutelle avec Institute of Mother and Child (IMC)
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé (Montpellier ; Ecole Doctorale ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : IGF - Institut de Génomique Fonctionnelle
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : PHYSIOPATHOLOGIE DE LA TRANSMISSION SYNAPTIQUE
• Jury : Président / Présidente : Beata Nowakowska
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Julie Perroy, Laetitia Mony, Katarzyna TOńSKA, Dorota Hoffman-zacharska, Susanne Schmidt
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Laetitia Mony, Katarzyna TOńSKA

Mots clés

Mots clés libres

Récepteur NMDA

Les encéphalopathies épileptiques développementales

Ngs

Synaptopathies

NMDA receptor

Developmental epileptic encephalopathies

Ngs

Synaptopathies

Résumé

Les encéphalopathies épileptiques développementales (DEEs) sont un groupe d'épilepsies sévères caractérisées par des convulsions et une activité épileptique interictale qui ont un impact négatif sur le développement neurologique. Grâce à une recherche multicentrique utilisant l'analyse en trio et le séquençage de nouvelle génération (NGS), dans le cadre du séquençage complet de l'exome, une série de gènes responsables des DEE ont été identifiés. Parmi eux, un grand groupe est engagé dans le processus de formation des synapses et leur bon fonctionnement. Des mutations de gènes codant pour des protéines synaptiques provoquent un certain nombre de maladies neurologiques, appelées ''synaptopathies''. Toute perturbation des processus de formation des connexions synaptiques entre les neurones entraîne la survenue de crises d'épilepsie. De nombreuses recherches ont montré que le récepteur N-méthyl-D-aspartate (NMDA), situé dans la membrane de l’élément post-synaptique d'un neurone, pouvait jouer un rôle clé dans la physiopathologie de plusieurs maladies neurologiques, notamment l'épilepsie. Son implication dans l'étiopathologie des DEE n'est pas encore entièrement comprise. L'objectif du projet était d'analyser l'implication d'un groupe de gènes codant pour des protéines qui jouent un rôle important dans la formation et le fonctionnement des synapses dans la pathogenèse des DEE. Le projet s'est particulièrement concentré sur le groupe de « gènes GRIN » codant pour des sous-unités des récepteurs NMDA comme cause de ces troubles. De plus, des études fonctionnelles ont été réalisées pour confirmer la pathogénicité des variants sélectionnés dans le gène GRIN2B et pour caractériser les propriétés de la protéine mutée in vitro, en utilisant des cellules HEK 293T transfectées et des neurones dérivés d'iPSC de patients. Afin de déterminer l’origine moléculaire de la maladie, l'analyse de 49 gènes, dont des mutations sont connues pour être responsables des DEE, a été réalisée sur une cohorte de 694 patients atteints d'épilepsie/DEE résistante aux médicaments. Le NGS ciblé a été utilisé pour ce faire. La base moléculaire de la maladie a été établie pour 18,4 % des patients. Les variants identifiés dans les «gènes synaptiques» (17 gènes sur 49 gènes) constituaient 37,4% de tous les variants identifiés, ce qui a montré un rôle important de ce groupe de gènes dans la pathogenèse des DEE. Parmi eux, 21 variants ont été identifiés dans les gènes GRIN codant pour des sous-unités de NMDAR. La caractérisation des variants générant les DEE a été suivie d'une analyse fonctionnelle détaillée pour l'un des variants pathogènes identifiés dans le gène GRIN2B – p.Glu839Ter - qui conduit à l'expression d'une protéine sans queue C-terminale. Une analyse fonctionnelle complète des déficiences moléculaires et cellulaires engendrées par la mutation a été réalisée. Les données obtenues ont montré que la queue C-terminale de la sous-unité GluN2B est nécessaire au bon fonctionnement du récepteur. Cependant, sa perte n'entraîne pas une perte complète de la fonction protéique. Le récepteur muté était moins exprimé à la surface cellulaire et présentait une amplitude de courant NMDA réduite avec une sensibilité plus élevée au blocage par le magnésium par rapport au récepteur WT. Malgré de nombreuses variantes pathogènes identifiées chez les patients atteints de DEE, un grand groupe de patients reste toujours sans diagnostic moléculaire, ce qui est causé par l’hétérogénéité moléculaire et génétique de la maladie, mais aussi par l'identification d'un grand groupe de variants classés en probablement pathogène ou VUS (variant of uncertain significance). Les analyses fonctionnelles réalisées pour de tels variants ainsi que les variants pathogènes sont une étape importante pour interpréter leurs conséquences cliniques et appliquer ou rechercher des traitements spécifiques.

Developmental and epileptic encephalopathies (DEEs) are a group of severe epilepsies characterized by seizures and interictal epileptic activity which negatively impacts neurodevelopment. Thanks to multicentre research using trio analysis and Next Generation Sequencing (NGS), within the framework of the whole exome sequencing (WES), mutations in a series of known and new genes causative for DEEs have been identified. Among them, there are mutations in genes encoding synaptic proteins which impair synapse formation and proper functioning causing a number of neurological diseases, which can be referred to as ''synaptopathies''. Any disturbance of the processes of forming synaptic connections between neurons leads to the occurrence of epileptic seizures. A substantial amount of research has shown that the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor, located in the post-synaptic membrane of a neuron may play a key role in the pathophysiology of several neurological diseases, including epilepsy, but its involvement in the etiopathology of DEEs is still not fully understood. The objective of the project was to analyze the involvement of a group of protein-encoding genes which play an important role in the formation and functioning of synapses in the pathogenesis of DEEs. The project focused in particular on the group of “GRIN genes” encoding subunits of NMDA receptors as the background of these disorders. Furthermore, functional studies were performed to confirm a pathogenicity of selected pathogenic variants in gene GRIN2B and to characterize the properties of mutated protein in vitro, using transfected HEK 293T cells and patients iPSC-derived neurons. In order to determine the molecular background of the disease, the analysis of 49 genes, in which mutations are known to be causative for DEEs, was performed for a cohort of 694 patients with recognized drug resistant epilepsy/DEE. Targeted NGS was used to do so. The molecular basis of disease was established for 18.4% of patients. Identified variants in “synaptic genes” (17 genes out of 49 genes) constituted 37.4% of all identified variants, which showed a big role of this group of genes in the pathogenesis of DEEs. Among them 21 variants were identified in GRIN genes encoding subunits of NMDARs. The characterization of the molecular background of DEEs was followed by a detailed functional analysis for one of the pathogenic variants identified in the GRIN2B gene – p.Glu839Ter causing the loss of the C-terminal part of the GluN2B protein. The obtained data showed that the C-tail of the GluN2B subunit is necessary for proper receptor functioning. However, its loss does not cause a complete loss of protein function. The mutated receptor was less expressed at the cell surface and displayed a reduced NMDA current amplitude with higher sensitivity to magnesium blockades compared to the WT receptor. Despite many pathogenic variants identified in patients with DEEs, a large group of patients still remains without a molecular diagnosis. This is caused by the molecular and genetic heterogeneity of the molecular background of DEEs, but also due to the identification of a large group of variants classified as likely pathogenic and variant of uncertain significance. Functional analyses performed for them as well as pathogenic variants is an important step to interpret their clinical consequences and apply or search for specific treatments.