Développement d'un système microfluidique pour l'expression sans clonage à haut débit d'anticorps

par Antoine Millereau

Projet de thèse en Physico-chimie

Sous la direction de Andrew Griffiths.

Thèses en préparation à l'Université Paris sciences et lettres , dans le cadre de École doctorale Chimie physique et chimie analytique de Paris Centre , en partenariat avec Chimie Biologie et Innovation (laboratoire) et de Ecole supérieure de physique et de chimie industrielles de la Ville de Paris (établissement opérateur d'inscription) depuis le 15-10-2018 .


  • Résumé

    Les progrès dans les technologies de découverte d'anticorps couplés aux innovations dans le séquençage d'adn de prochaine génération et l'analyse de contenu élevée, ont permis la génération de milliers d'anticorps monoclonaux (mAbs) dans des campagnes de découverte d'anticorps. Les processus à haut débit (HTP) génèrent un grand nombre d'anticorps dans un délai d'exécution rapide pour le dépistage et la sélection. Toutefois, le dépistage initial et la sélection ne sont généralement basés que sur la liaison et non sur l'activité désirée du mAb, qui n'est souvent pas dans le format désiré pour une utilisation finale. Plus tard dans le cadre du projet de découverte d'anticorps, les hits et les variantes de mAb sont souvent convertis en différents formats (FAB, IgG, multispécifiques, variantes de isotype, etc.) pour s'adapter au mode d'action désiré, en utilisant des processus supplémentaires de HTP pour soutenir la petite échelle expression de milliers de mAbs. Ceci passe par le clonage moléculaire de leurs séquences de domaine variables lourdes et légères dans les vecteurs d'expression qui sont encore transitoirement transfectées dans les cellules de mammifères pour le criblage dans le format final et finalement poussés à la purification à petite échelle. Le clonage PCR amplifiés ou synthétiques gènes de domaine variable dans un vecteur d'expression exige typiquement la croissance sur des plaques d'agar et le criblage de plusieurs clones qui contiennent l'insert désiré. La littérature rapporte diverses stratégies de clonage pour créer des clones d'expression avec une diminution du temps, des coûts et des efforts. Les méthodes populaires de ligase ‐ indépendantes sont généralement plus rapides et présentent des efficacités de clonage plus élevées que les protocoles plus traditionnels basés sur la ligature cependant, la plupart de ces protocoles souffrent de la cueillette de colonies et des exigences de séquence comme taux de clonage incorrect reste aussi élevé que 5 à 10%. L'ensemencement de centaines de transformations bactériennes sur des géloses et le criblage de plusieurs colonies de chaque plaque est extrêmement long et le débit est faible. Par conséquent, le nombre d'anticorps pouvant être clonés et exprimés en utilisant de telles méthodes est limité par le temps et les ressources. Il y a donc un besoin non comblé d'un système efficace, rapide et rentable de clonage libre de reformater et d'exprimer un grand nombre (dizaines de milliers) de mAbs et des variantes pour L'expression dans les cellules de mammifères dans le format correct pour le mode d'action désiré. Le but de la thèse est donc de contourner ces limites et de développer un système microfluidique pour l'expression sans clonage à haut débit d'anticorps

  • Titre traduit

    Development of a microfluidic system for high throughput cloning‐free expression of antibodies


  • Résumé

    Generation of antibodies against a given antigen is feasible with a variety of methodologies and technologies. It can go through screening of the antibody repertoire of immunized animals by classical hybridoma generation or memory B cell sorting by FACS. More recently, droplet- based microfluidics has been shown to be an effective solution to increase efficiency and reduce time to identify antibodies showing functional properties. Display technologies such as phage display and yeast have also proven to be a robust and convenient technology for the selection of human antibodies from diverse libraries. Advances in antibody discovery technologies coupled with innovations in next generation DNA sequencing and high content analysis, have enabled the generation of thousands of monoclonal antibodies (mAbs) in antibody discovery campaigns. High throughput (HTP) processes generate large numbers of antibodies within a fast turnaround time for screening and selection. However, initial screening and selection is typically based only on binding and not the desired activity of the mAb, which is frequently not in the desired format for end use. Later in the course of the antibody discovery project, mAb hits and variants are often converted into various formats (Fab, IgG, multispecific, isotype variants, etc) to fit with the desired mode of action, using additional HTP processes to support small scale expression of thousands of mAbs. This goes through molecular cloning of their heavy and light variable domain sequences in expression vectors which are further transiently transfected in mammalian cells for screening in final format and eventually pushed to small-scale purification. Cloning PCR amplified or synthetic variable domain genes into an expression vector typically requires growth on agar plates and screening of multiple clones that contain the desired insert. The literature reports diverse cloning strategies for creating expression clones with decreased time, cost and efforts. Popular ligase‐independent methods are generally faster and exhibit higher cloning efficiencies than more traditional ligation-based protocols However, most of these protocols suffer from colony picking and sequence requirements as incorrect clone rate remains as high as 5 to 10%. Plating hundreds of bacterial transformations on agar plates and screening multiple colonies from each plate is extremely time consuming and low throughput. Consequently, the number of antibodies capable of being cloned and expressed using such methods is limited by time and resources. There is thus an unmet need for an efficient, rapid and cost-effective cloning-free system to re-format and express large numbers (tens of thousands) of mAb hits and variants for expression in mammalian cells in the correct format for the desired mode of action. As a consequence, the goal of the PhD will be to bypass these limits and develop a microfluidic system for high throughput cloning‐free expression of antibodies.