SIGNALER une erreur

Etude du microenvironnement des lymphomes cutanés B

par Sarah Menguy

Thèse de doctorat en Biologie Cellulaire et Physiopathologie

Sous la direction de Anne Liên Pham-Ledard.

Thèses en préparation à Bordeaux , dans le cadre de École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Bordeaux) , en partenariat avec Merlio (laboratoire) .


  • Résumé

    Parmi les lymphomes primitifs cutanés, environ 25% sont de phénotype B. Ils regroupent 3 entités principales: lymphome B centro-folliculaire (LBCF) et lymphome B de la zone marginale (LBZM), qui sont indolents, et lymphome B diffus à grandes cellules de type jambe (LBTJ), de comportement agressif. Dans les tumeurs solides et plus récemment pour les lymphomes, les traitements ciblant le microenvironnement tumoral (TME) ou "immunothérapies" se développent et ont montré leur efficacité. Pour développer ces thérapeutiques dans les lymphomes, il est nécessaire de connaitre la composition du microenvironnement immunitaire et de comprendre les mécanismes participant à l'échappement tumoral. Dans les lymphomes B cutanés (LBC), peu de choses sont connues sur les cellules immunitaires constituant le TME, en particulier, leur type, leur localisation par rapport à la tumeur, et leur profil d'expression. L'objectif du projet était de comparer la composition du TME d'une série de 20 LBC regroupant 10 LBTJ, 5 LBCF et 5 LBZM, afin de déterminer des facteurs associés à l'agressivité clinique. Pour étudier le TME, nous avons développé 2 techniques du multiplexage en immunofluorescence. Le multiplexage permet de visualiser sur une seule et même coupe de tissu jusqu'à 8 marqueurs différents. Le panel pour l'étude des lymphocytes T intra tumoraux (TILs), qui incluait les anticorps CD20, CD3, CD8, FOXP3, PD1, Granzyme B et Ki67, a été réalisé par une technique automatisée à l'aide des kits OPAL® (Akoya Bioscience). Le panel pour les cellules myéloïdes, qui incluait les anticorps CD19, CD68, CD163, CD11c, CD33, PDL1, IDO et CSF1R, était une technique manuelle de marquages séquentiels. Les images ont été exploitées à l'aide du logiciel d'analyse d'images HALO® (Indica Labs). LBTJ avaient significativement moins de TILs que les LBCF et LBZM (p=0.0280), et ils étaient mêlés à la prolifération tumorale, alors que dans les LBCF et LBZM, les TILs se localisaient autours des nodules tumoraux et s'insinuaient plus ou moins dans la prolifération tumorale. Dans les LBTJ, les TILs étaient composés d'un mélange de CD4 et CD8, alors que les CD4 étaient prédominants dans les LBZM et LBCF. Les TILs prolifératifs Ki67+ étaient plus abondants dans les LBTJ (p=0.0006). Dans les LBTJ, une densité élevée de TILs prolifératifs (CD3+Ki67+ > 500/mm²) était associée à une meilleure survie sans progression (p=0.0101). Par ailleurs, une densité élevée de cellules cytotoxiques Granzyme B+ (>600/mm²) était associée à une meilleure survie sans progression pour tous les LBC (p=0.0259). Les macrophages et en particuliers les M2 (CD68+CD163+) étaient plus nombreux dans les LBTJ que dans les LBCF et les LBZM (respectivement p=0.0044 et p=0.0001). Il n'y avait pas de différence pour les cellules dendritiques (CD11c+CD68-) entre les 3 entités. Les cellules myéloïdes suppressives étaient très rares. Les cellules PDL1+ et en particulier les macrophages PDL1+ étaient plus représentés dans les LBTJ (p=0.0001 et p=0.0002). IDO semblait plus exprimé dans les LBTJ. Il existait une corrélation entre l'expression de CSF1R et la densité de macrophages M2 (p=0.0263). Dans les LBTJ, une abondance de macrophages M1 (surface de marquage >0,75%) était associée à une meilleure survie spécifique (p=0.0431). Par multiplexage, nous avons montré que le TME des LBC était différent dans sa composition et dans son organisation spatiale selon les sous-types. Le TME des LBTJ (lymphome agressif) était riche en macrophages surtout M2, mais pauvre en TILs, comparé aux lymphomes indolents. La présence de TILs prolifératifs et cytotoxiques impactait la survie. La connaissance du TME apporte des informations utiles pour pouvoir modéliser in vitro des LBC (co cultures de cellules tumorales et myéloïdes en 2D et encapsulation 3D). La mise en évidence de facteurs du TME liés à l'agressivité clinique constitue également des pistes de cibles thérapeutiques potentielles, comme par exemple les anti-PDL1 dans les LBTJ.

  • Titre traduit

    Tumor microenvironment in cutaneus B-cell lymphomas


  • Résumé

    Among primary cutaneous lymphoma, about 25% are B-cell lymphoma. They include 3 main entities: large B-cell lymphoma, leg type (PCLBCL-LT), aggressive subtype, and follicle center lymphoma (PCFCL) and marginal zone lymphoma (PCMZL), two indolent subtypes. In solid tumors and more recently for lymphomas, treatments targeting the tumor microenvironment (TME) are in development and have shown their effectiveness. To develop these therapies in lymphoma, it is necessary to know the composition of the immune microenvironment and understand the mechanisms involved in tumor escape. In cutaneous B-cell lymphoma (CBL), little is known about the immune cells constituting the TME, in particular, which cell types, architecture (relation to the tumor), and their expression profile. The objective of our project was to compare the composition of the TME in a series of 20 CBL comprising 10 PCLBCL-LT, 5 PCFCL and 5 PCMZL, in order to identify factors associated with clinical aggressiveness. To study TME, we developed 2 techniques of immunofluorescence multiplexing. Multiplex staining allows viewing up to 8 markers on a single tissue section. The panel for studying tumor infiltrating lymphocytes (TILs) that included CD20, CD3, CD8, FOXP3, PD1, Granzyme B and Ki67, was carried out by an automated technique using OPAL® kits (Akoya Bioscience). The panel for myeloid cells, that included CD19, CD68, CD163, CD11c, CD33, PDL1, IDO1 and CSF1R, was a manual technique of sequential staining. The resulting images were analyzed using an image analysis software, HALO® (Indica Labs). PCLBCL-LT exhibited less TILs than PCFCL and PCMZL (p=0.0280), TILs were sparsely intermingled within diffuse tumor infiltrate. In PCFCL and PCMZL, TILs were scattered around tumor nodule edges with variable intra-tumoral infiltration. In PCLBCL-LT, TILs were composed of CD8 and CD4 cells, while CD4 were predominant in indolent PCBCL. Proliferative TILs (CD3+Ki67+) were more abundant in PCLBCL-LT (p=0.0006). In PCLBCL-LT subtype, proliferative TILs abundance (CD3+Ki67+ density> 500/mm²) was associated with better progression free survival (p=0.0101). Among all PCBCL, high granzyme B+ cell density (>600/mm²) was associated with better progression free survival (p=0.0259). Macrophages and in particular M2 (CD68+CD163+) were more abundant in PCLBCL-LT than in PCFCL and PCMZL (p=0.0044 and p=0.0001, respectively). Dendritic cells (CD11c+CD68) were present in all PCBCL without difference according to entities. Myeloid derived suppressor cells (CD33+CD68-) were very rare in all cases. PDL1+ cells, in particular macrophages PDL1+, were more numerous in PCLBCL-LT (p=0.0001 and p=0.0002, respectively). IDO+ cells seemed to be numerous in PCLBCL-LT. CSF1R+ cells density was correlated to M2 macrophages density (p=0.0263). PCLBCL-LT with M1 stained area >0.75% had better specific survival (p= 0.0431). Using multiplex staining, we showed that TME of CBL was different in composition and spatial organization depending on the subtype. TME of PCLBCL-LT was macrophages rich, especially M2, and poor in TILs. The proliferative and cytotoxic nature of TILs affected outcome. The knowledge of TME provides useful information for in vitro CBL models (tumor and myeloid cell in 2D co-cultures or 3D capsules). Identification of TME factors related to clinical aggressiveness is also an indication of potential therapeutic targets, such as anti-PDL1 in PCLBCL-LT.