Organisation fonctionnelle du pôle de la bactérie

Functional organization of bacterial cell pole

• Auteur / Autrice : Guillaume Abriat
• Direction : Yoshiharu Yamaichi
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Inscription en doctorat le 01/10/2018
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Structure et dynamique des systèmes vivants (Gif-sur-Yvette, Essonne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : I2BC - Institut de Biologie Intégrative de la Cellule
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Faculté des sciences d'Orsay

Mots clés

Mots clés libres

Motilité

Flagelle

Polarité

Vibrio cholerae

HubP

Chimiotaxie

HubP

Flagella

Motility

Polarity

Vibrio cholerae

Chemotaxis

Résumé

Notre laboratoire s'intéresse à l'étude des facteurs et des mécanismes qui engendrent l'organisation subcellulaire des cellules bactériennes, en se concentrant particulièrement sur le développement et l'organisation fonctionnelle du pôle cellulaire. Récemment, différentes protéines polaires qui agissent comme des plateformes « polar hub » en permettant le recrutement de protéines de diverses fonctions ont été identifiées dans plusieurs espèces bactériennes. Ainsi, l'organisation du pôle de la bactérie apparait fondamentalement importante pour le cycle de vie bactérien (Davis and Waldor, 2013; Lin et al., 2017). De plus, ces bactéries montrent également une polarité avec des caractéristiques différentes entre les anciens et les nouveaux pôles cellulaires. Nous utilisons, comme organisme modèle, Vibrio cholerae, la bactérie en forme de bâtonnet, Gram négative, responsable du choléra, particulièrement motile grâce à son flagelle polaire unique. V. cholerae est différente des autres modèles bactériens par l' architecture de son génome ; possédant deux chromosomes circulaires au lieu d'un. La protéine HubP (de « hub of the pole ») se localise au pôle cellulaire et permet l'attachement de trois ATPase dans V. cholerae : ParA1 pour la ségrégation des chromosomes, ParC pour le recrutement de la machinerie impliquée dans la chimiotaxie et FlhG pour la biosynthèse du flagelle (Yamaichi et al., 2012). En outre, nous avons récemment découvert quelques nouvelles protéines polaires dont la localisation dépend de HubP. Parmi ces nouveaux partenaires d'interaction, deux protéines précédemment non caractérisées (nommées MotV et MotW) ont été décrites comme impliquées dans la motilité, probablement à travers des signaux de chimiotaxie et/ou l'interaction avec le moteur flagellaire. Je propose ici un sujet de thèse dans lequel il/elle poursuivra des expériences pour mieux comprendre la formation et l'organisation de la polarité dans les cellules bactériennes, en mettant surtout l'accent sur la caractérisation fonctionnelle de HubP, MotV et MotW. Il a été montré que ces protéines polaires présentent différentes uni-/bi-polarités durant le cycle cellulaire ce qui pourrait être impliqué dans la maturation ou la formation du pôle cellulaire. De plus, il a été suggéré que leur niveau d'expression pouvait altérer leur profil de localisation. Afin de caractériser les étapes de maturation des pôles cellulaires, la localisation précise et la dynamique de ces protéines seront abordées via des techniques de microscopie en épi-fluorescente et super-résolution dont l'imagerie time-lapse, le FRAP et le suivi de molécules uniques. Les expériences de microscopie dans les différents contextes génétiques (par exemple des mutants pour d'autres protéines polaires) pourraient avoir des implications sur l'ordre et la hiérarchie de l'organisation du pôle cellulaire. L'expression des protéines polaires, le circuit de régulation et la fluctuation au cours du cycle cellulaire seront abordés par une approche génétique, de la microscopie et de la cytométrie de flux. Les interactions protéine-protéine et l'assemblage du complexe multiprotéique seront étudiés via des approches in vivo et in vitro, comme le pull-down, le double hybride ou encore des méthodes BioID. Les interactions génétiques qui coordonnent les différents procédés cellulaires seront également étudiées. Dans ce but, des approches de séquençage nouvelle génération telles que le TnSeq ou le « Whole genome sequencing » seront effectuées. La réalisation de ces objectifs mettra en lumière l'organisation sophistiquée des cellules bactériennes en rapport avec leur coordination fonctionnelle. Même si des idées fondamentales de la biologie microbienne seront étudiées, les résultats de ce projet pourront ouvrir sur des applications ou des perspectives traductionnels car nous travaillons sur un organisme pathogène.

Our lab is interested in exploring the factors and mechanisms that generate the subcellular organization of bacterial cells, particularly focusing on development and functional organization of the cell pole. Recently, distinct 'polar hub' proteins that tether proteins in diverse functions are identified in various bacterial species, suggesting that organization of cell pole is fundamentally important for bacterial life cycle (Davis and Waldor, 2013; Lin et al., 2017). In addition, these bacteria also exhibit polarity with different features between old and new cell poles. We use Vibrio cholerae, the cholera pathogen Gram negative rod bacterium which is highly motile with monotrichous flagellum, as the model organism. V. cholerae has been distinguished from other model bacteria by its composition of genome; possessing two circular chromosomes rather than one. HubP protein (from hub of the pole) localizes at the cell pole and anchors 3 ATPase in V. cholerae: ParA1 for chromosome segregation, ParC for recruiting chemotaxis apparatus, and FlhG for flagella biosynthesis (Yamaichi et al., 2012). In addition, we recently revealed a few new polar proteins that their polarity depends on HubP. Among these novel interaction partners, two previously uncharacterized proteins (now we named as MotV and MotW) are shown to be involved in cell motility, possibly through chemotaxis signaling and/or polar flagellum motor. Here I propose a thesis project which s/he will pursue experiments to gain further understanding of the generation and organization of polarity in bacterial cells, in specific focus on functional characterization of HubP, MotV and MotW. These polar proteins are shown to present distinct uni-/bi-polarlity during the cell cycle which could implicate maturation or licensing of the cell pole. Furthermore, it was suggested that expression level can alter their localization pattern. In order to characterize the maturation steps of the cell poles, precise localization and dynamics of these proteins will be addressed in epi-fluorescent and super-resolution microscopy including time-lapse imaging, FRAP and single-molecule tracking. Microscopy experiments in different genetic background (e.g. mutant of other polar components) could give implications for the order and hierarchy of cell pole organization. For the expression of polar proteins, regulatory circuit and fluctuation during the cell cycle will be addressed by genetic approach, microscopy and flow cytometry. Protein-protein interactions and assembly of multiprotein complex will be studied in vivo and in vitro approaches including pull-down, two-hybrid and BioID methods. Genetic interactions to coordinate different cellular processes will be also investigated. For this purpose, next-generation sequencing-based approaches such as Tnseq and whole genome sequencing of suppressors will be taken. Accomplishments of these aims would shed light on the sophisticated bacterial cell organization which implies the functional coordination. Even though s/he addresses fundamental insights on microbial cell biology, findings from this project can open on applied and translational perspectives as we work on a pathogen.