Application et développement de méthodes de polarisation nucléaire dynamique avec dissolution (D-DNP) à l'étude de divers aspects du métabolisme cellulaire.

Application and development of dissolution dynamic nuclear polarization techniques for kinetic studies of metabolic reactions

• Auteur / Autrice : David Guarin
• Direction : Daniel Abergel
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Chimie Physique
• Date : Inscription en doctorat le 01/09/2017
• Etablissement(s) : Université Paris sciences et lettres
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Chimie physique et chimie analytique de Paris Centre (Paris ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire des biomolécules (Paris ; 2009-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : École normale supérieure (Paris ; 1985-....)

Mots clés

Mots clés libres

Ddnp

Métabolisme Cellulaire

Rmn

Cinetique Enzymatique

Culture cellulaire

Dnp

Ddnp

Cell metabolism

Nmr

Fluxomics

Cell culture

Enzyme kinetics

Résumé

Depuis l'invention de la polarisation nucléaire dynamique de dissolution (DDNP)1 et l'amélioration spectaculaire du signal qu'elle fournit dans la RMN à l'état de solution, un large éventail d'applications ont vu le jour. En particulier, cette amélioration ouvre de nouvelles voies pour l'étude des processus dynamiques rapides tels que les réactions chimiques, avec une résolution temporelle inférieure à une seconde. Le DDNP s'est révélé particulièrement intéressant pour l'étude de processus métaboliques tels que les réactions enzymatiques qui sont influencées par de nombreux facteurs, comme le régime alimentaire ou l'environnement. Ces réactions peuvent maintenant être étudiées in vitro et sur des cellules, ce qui permet d'accéder à la nature et au degré d'altération possible des cellules. Nous avons lancé des études cinétiques des réactions enzymatiques utilisant le DDNP sur le stade oxydatif de la voie du pentose phosphate (oxPPP)2, l'une des voies métaboliques cruciales dans les cellules. L'oxPPP produit du NADPH, l'une des principales sources de pouvoir réducteur dans la cellule. Elle est composée de trois enzymes : Glucose-6-Phosphate déshy- drogénase (G6PDH), 6-Phosphogluconolactonase et 6-Phosphogluconic acid déshydrogenase. En étudiant la cascade enzymatique impliquant l'Hexokinase et la G6PDH, nous pourrions extraire les paramètres cinétiques pertinents impliqués dans le processus. La complexité de la voie cinétique et le grand nombre de paramètres du modèle en font une tâche particulièrement exigeante qui nécessite la répétabilité des expériences. L'ajustement des courbes d'accumulation de signaux des multiples métabolites nous a permis d'extraire les paramètres cinétiques pertinents. Cela a montré une corrélation satisfaisante avec les activités enzymatiques utilisées dans les expériences. En parallèle, les expériences cellulaires réalisées sur E. coli ont permis de fournir une vue globale et quantitative du métabolisme du glucose en fonction de la croissance cellulaire et des conditions de stress cellulaire. En particulier, le différentiel d'absorption anomérique du glucose par les cellules est apparu comme un indicateur des activités relatives de la glycolyse et du PPP.

Since the invention of dissolution Dynamic Nuclear Polarization (DDNP)1 and the dramatic signal enhancement it provides in solution-state NMR, a wide range of applications have emerged. In particular, this improvement opens new avenues for the study of fast dynamical processes such as chemical reactions, with a time resolution smaller than a second. DDNP has proven of particular interest in the study of such metabolic processes as enzymatic reactions that are affected by many factors, such as dietary or environmental. These reactions can now be studied in vitro and in cell, providing access to the nature and degree of possible cell impairment. We have initiated kinetic studies of enzymatic reactions using DDNP on the oxidative stage of the Pentose Phosphate Pathway (oxPPP)2, one of the crucial metabolic pathways in cells. OxPPP produces NADPH, one of the main sources of reductive power in the cell. It comprises three enzymes: Glucose-6-Phosphate dehy- drogenase (G6PDH), 6-Phosphogluconolactonase and 6-Phosphogluconic acid dehydrogenase. By studying the enzymatic cascade involving Hexokinase and G6PDH, we could extract the relevant kinetic parameters involved in the process. The complexity of the kinetic pathway and the large number of model parameters makes it a particularly demanding task that requires the repeatability of the experiments. Fitting the signal build-up curves of the multiple metabolites allowed us to extract the relevant kinetic parameters. This showed satisfactory correlation with the enzyme activities used in the experiments. In parallel, in cell experiments performed on E. coli allowed to provide a global ans quantitative view of Glucose metabolism in function of the cell-growth and cell stress conditions. In particular, the differential α/β anomeric Glucose uptake by the cells appeared as an indicator of the relative activities of Glycolysis and PPP.