Biocapteur polyvalent pour décrypter les activités glycoenzymatiques

par Daniel Marquez Martin

Projet de thèse en Chimie Biologie

Sous la direction de Didier Gasparutto, Olivier Lerouxel et de Aurélie Bouchet-spinelli.

Thèses en préparation à l'Université Grenoble Alpes , dans le cadre de École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble) , en partenariat avec Systèmes Moléculaires et Nano Matériaux pour l'Énergie et la Santé (laboratoire) et de CIBEST (equipe de recherche) depuis le 08-11-2017 .


  • Résumé

    À ce jour, les glycosyltransférases (GT) sont une famille essentielle d'enzymes mal caractérisées à la fois structurellement et mécaniquement, ce qui constitue une limitation majeure dans le domaine des glycosciences. Ces enzymes jouent un rôle crucial dans les organismes vivants en catalysant le transfert stéréo- et régio-spécifique d'un sucre donneur activé vers une molécule acceptrice, pour construire des oligosaccharides complexes à la surface des cellules. La mise au point de nouveaux outils analytiques est nécessaire pour analyser et caractériser les interactions entre ces enzymes et les glycanes, dans une approche à haut débit. Dans ce contexte, l'imagerie par résonance plasmonique de surface (SPRi) apparait comme une méthodologie adaptée et polyvalente pour répondre à cette demande de criblage de ligands et de suivi des interactions biomoléculaires, en temps réel et sans marquage. Par conséquent, ce projet de recherche multidisciplinaire est organisé en trois axes principaux : dans un premier temps, nous abordons l'expression hétérologue et la purification d'une fucosyltransférase de la plante Arabidopsis thaliana (AtFUT1) qui participe à la dernière étape de la biosynthèse du ligand xyloglucan (XyG). Ensuite, les approches d'immobilisation spéci ques des résidus glycanes sur surface ont motivé la conception de stratégies chimiosélectives pour conjuguer les entités XyG à des échafaudages oligonucléotidiques avec de bons rendements. La polyvalence des structures ODN conjuguées aux glycanes fournit des informations et propriétés pré- cieuses pour les étapes de puri cation et de caractérisation des glycanes, ainsi que pour leur immobilisation. En n, le troisième axe est consacré à la conception et à la construction d'une glyco-puce XyG polyvalente, par une approche d'immobilisation spéci que dirigée par l'ADN (DDI). Cette stratégie conduit au développement final d'un outil analytique original basé sur la puissante technique SPRi, qui permet la visualisation et la caractérisation des interactions biomoléculaires en temps réel et sans marquage.

  • Titre traduit

    Versatile biosensor for deciphering glycoenzymatic activities


  • Résumé

    To date, glycosyltransferases (GTs) are an essential family of enzymes poorly characterized both structurally and mechanistically which is being a major bottleneck in Glycoscience. They play a crucial role in living organisms catalysing the stereo and regiospecific transfer of an activated donor sugar to an acceptor moiety to build up complex oligosaccharides onto the cell surface. New analytical tools are requiredto screen enzyme-glycan interactions in high-throughput manner. In this context, Surface Plasmon Resonance imaging (SPRi) has spread as a versatile methodology to overcome this glycoscienti c demand for ligands screening and biomolecular interaction monitoring at real time and without any labels. Therefore, this multidisciplinary project is organized in three main axes: First, we address the heterologous expression of a fucosyltransferase from the plant Arabidopsis thaliana (AtFUT1) (CAZy family GT37) that participates in the last step in the biosynthesis of xyloglucan (XyG) ligand. Then, specific immobilization approaches using DNA architectures motivate the design of chemoselective strategies to conjugate XyG building-blocks to oligonucleotidic scaffolds in good yields. The versatility of having ODN structures conjugated to glycans provides powerful insights for glycan purification, characterization and also immobilization approaches on solid support. In this matter, the third axis is dedicated towards the conception and construction of a versatile XyG glycochip for its specific immobilization approach by DNA-Directed Immobilization (DDI). This strategy is envisioned through the powerful SPRi technique that allows the simultaneous visualization of binding events without using any label molecule in real time measurements.