Rôle des génomes défectifs des arbovirus dans la régulation de l’infection des insectes

Role of viral defectives genomes of arboviruses in regulating viral infection in insects

• Auteur / Autrice : Enzo Poirier
• Direction : Marco Vignuzzi
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé. Microbiologie
• Date : Soutenance le 13/10/2017
• Etablissement(s) : Sorbonne Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Unité de Virologie moléculaire et Vaccinologie (Paris)
• Partenaire(s) de recherche : établissement de préparation : Université Paris Diderot - Paris 7 (1970-2019)
• Jury : Président / Présidente : Sylvie Van der Werf
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Marco Vignuzzi, Sylvie Van der Werf, Carolina B López, Jean-Luc Imler, Marie Flamand, Susan Carpenter
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Carolina B López

Mots clés

Mots clés contrôlés

croissance et développement

Virus

Infections à virus à ARN

ARN interférence

Arbovirus

Mots clés libres

Génomes défectifs

Persistence virale

Dicer-2

Defective genomes

Viral persistence

Dicer-2

Résumé

Les arbovirus tels que la dengue, chikungunya ou zika, qui circulent entre les humains et les moustiques, sont responsables d'importantes épidémies touchant des centaines de millions de personnes par an. Le cycle de transmission des arbovirus dépend en partie de la persistence du virus chez l'insecte. Une infection est dite persistente quand, malgré une réplication virale soutenue avec production de multiples particules virales, l'infection n'affecte peu ou pas la santé de l'insecte. En d'autres termes, l'infection persistente est quasi asymptomatique, ce qui favorise grandement la transmission du pathogène à un nouvel hôte. La persistence d'un virus à ARN chez l'insecte a été étudiée chez la mouche du vinaigre (Drosophila melanogaster) ainsi que chez les moustiques, et s'appuie sur l'ARN interférence, qui repose sur la reconnaissance de l'ARN double brin viral par la protéine Dicer-2. L'effet antiviral de l'ARN interférence dépend également de la production d'ADN viral (ADNv) à partir d'ARN viral durant l'infection, via l'action des rétrotransposons cellulaires. L'ADNv est ensuite transcrit afin de soutenir l'ARN interférence, ce qui établit et maintient la persistence virale chez la drosophile et le moustique. L'origine de l'ARN viral rétrotranscrit, ainsi que les mécanismes de régulation de la production d'ADNv, ne sont pas connus. Une grande majorité des arbovirus sont des virus à ARN qui codent pour leur propre ARN polymérase, responsable de la réplication du génome durant le cycle viral. Ces polymérases sont caractérisées par un fort taux de mutation et de recombinaison, ce dernier paramètre corrélant avec la génération de génomes défectifs, tronqués pour une ou plusieurs parties de la séquence virale. Ces génomes défectifs ont été isolés chez l'écrasante majorité des virus à ARN, et sont connus pour leur forte capacité à stimuler l'interféron de type I chez les mammifères, via l'activation des réceptors "RIG-I-like", ou RLRs. Ainsi, les génomes défectifs sont considérés comme de puissants Pattern-Associated Molecular Patterns (PAMPs), ou structures virales qui sont reconnues comme "non-soi" par l'hôte et activent l'immunité. L'effet des génomes défectifs sur l'immunité antivirale des insectes, et en particulier sur l'ARN interférence, n'est pas connu. Dans ce travail, nous avons cherché à étudier le rôle des génomes défectifs lors de l'infection des insectes, en relation avec l'activation de l'ARN interférence. Pour ce faire, nous avons caractérisé un mutant du virus Sindbis (Sindbis-highDG) possèdant un taux de recombinaison plus important. En conséquence, ce virus produit une quantité plus importante de génomes défectifs en culture cellulaire. Dans une deuxième temps, nous avons utilisé ce virus, ainsi que d'autres outils, pour déterminer le rôle des génomes défectifs lors de l'infection d'un insecte par un virus à ARN. Nous avons démontré que Sindbis-highDG produit davantage de génomes défectifs que le virus sauvage chez Drosophila. Nous démontrons ensuite que la quantité de génomes défectifs produite durant l'infection contrôle le taux de réplication du virus via l'activation de l'ARN interférence. Les génomes défectifs sont en effet rétrotranscrits en ADNv. Plus la réplication virale produit de génomes défectifs, plus la quantité d'ADNv rétrotranscrite est importante. De plus, la production de génomes défectifs régule la persistence virale. La suite de notre étude se penche sur les mécanismes de régulation de ce phénomène. Nous démontrons que la rétrotranscription des génomes défectifs viraux en ADNv est régulée par l'hélicase de la protéine Dicer-2. Ce domaine hélicase est de plus conservé dans les RLRs. Ainsi, notre travail à mis au jour une convergence fascinante entre l'immunité des insectes et des mammifères, en ce qui concerne la nature du PAMP detecté (les génomes défectifs) ainsi que la régulation de la réponse immune (domaine hélicase).

RNA viruses transmitted by arthropods such as mosquitoes, termed arboviruses, are responsible for millions of human infections each year, as well as important economic losses. Some of them, such as chikungunya virus, lack efficient vaccination or prophylaxis treatment. Their transmission cycle greatly relies on the infection being persistent in the insect host, i.e. viral replication continues to high titers with merely no symptoms for the host. On a molecular level, control of viral infection in the insect relies on RNA interference, a pathway where viral double-stranded RNA is recognized by the Dicer-2 protein and helps target viral RNA by generating small-interfering RNAs. Recent work also described the generation of viral DNA through reverse transcription of viral RNA by cellular retrotransposons. Viral DNA is further transcribed and feeds the canonical machinery of RNA interference with small-interfering RNAs. Notably, chemical inhibition of viral DNA synthesis impairs virus persistence in the host, suggesting a central role for viral DNA in the establishment of persistence. However, the regulation of viral DNA synthesis, as well as the templates used to produce the molecule, remain to be elucidated.RNA viruses encode their own RNA polymerase, which replicates the viral genome. Being largely error-prone, these polymerases can recombine different templates during replication, giving rise to rearranged or deleted genomes. Such viral genomes, termed defective genomes, are strong immunostimulators of mammalian immunity through the binding of RIG-I–like receptors and the activation of type-I interferon. The interplay between defective genomes and insect immunity during arbovirus infection has however not been thoroughly deciphered. In this work, we aim at assessing the role of defective genome production during RNA virus infection in insects. To do so, we focus on the insect model Drosophila, and Sindbis virus, a prototypical arbovirus. We first isolate a mutant of Sindbis virus that recombines at a higher rate compare to its wildtype counterpart, leading to the overproduction of defective genomes. When introduced in fruit flies, this mutant displays a drop in titer dependent on RNA interference, underlining that overproduction of defective genomes triggers viral attenuation. We further demonstrate that defective genomes are reverse transcribed in viral DNA, which boosts the RNA interference machinery, thereby leading to the attenuation of the virus. We also uncover a role for defective genomes in establishing and maintaining viral persistence in fruit flies. Notably, we demonstrate that the regulation of defective genome reverse transcription into viral DNA is regulated by the helicase domain of Dicer-2. Because this domain is phylogenetically related to the helicase domain of RIG-I–like receptors, preferentially detecting arboviral infection in mammals, our work reveals a striking convergence between mammalian and insect immunity. Additionally, we demonstrate that this pathway is conserved in mosquitoes, opening new avenues of research in the necessary fight against mosquito-borne viral diseases.