Dynamique des premiers stades de l'adhésion cellulaire sur les substrats fluides

Dynamics of early stages of cell adhesion on fluid substrates

• Auteur / Autrice : Oleg Mikhajlov
• Direction : Patricia Bassereau, Guy Tran van nhieu
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Physique
• Date : Inscription en doctorat le ; Soutenance le 11/03/2021
• Etablissement(s) : Université Paris sciences et lettres
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Physique en Île-de-France (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Physique des Cellules et Cancer (Paris ; 2024-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Institut Curie (Paris ; 1978-....)
• Jury : Président / Présidente : Françoise Brochard
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Patricia Bassereau, Johanna Ivaska, Jay Groves, René-Marc Mege, Guy Tran van nhieu
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Johanna Ivaska, Jay Groves

Mots clés

Mots clés libres

Adhésion cellulaire

Méchanotransduction

Intégrine

Microscopie à fluorescence

Mécanique cellulaire

Cytosquelette d'actine

Cell adhesion

Mechanotransduction

Integrin

Fluorescence microscopy

Cell mechanics

Actin cytoskeleton

Résumé

L'adhésion est un phénomène omniprésent dans le monde cellulaire. C'est le principal moyen d'interaction entre les cellules et l'environnement extérieur. Ces interactions sont orchestrées par des molécules réceptrices à la surface des cellules (parmi elles, les intégrines) et par environ 200 protéines d'adhésion qui constituent l'adhésome et qui connectent le site d'adhésion (contact entre la cellule et le substrat externe) au cytosquelette. L'adhésome est un organe sensoriel de la cellule qui lui permet de ''sentir'' la composition moléculaire ou la rigidité du substrat en exerçant des forces sur les substrats, par un processus de rétroaction appelé mécano-détection. Par exemple, les cellules peuvent distinguer les substrats adhésifs recouverts de ligands spécialisés de ceux qui ne le sont pas ou qui sont recouverts de molécules répulsives ; elles peuvent également différencier les substrats rigides comme le verre, des gels mous ou même des membranes fluides. Ces propriétés des substrats peuvent influencer le devenir et le comportement des cellules (de la différenciation des cellules souches à la migration des cellules) par le biais de l'adhésion. Nous avons étudié l'adhésion de cellules sur des bicouches lipidiques supportées (SLB) fonctionnalisées avec des ligands diffusant librement à leur surface. Les SLBs imitent les membranes cellulaires dans l'interaction cellule-cellule et leurs propriétés mécaniques limitent la gamme des forces que les cellules peuvent exercer. Par conséquent, ce système permet d'étudier la dynamique de l'adhésion cellulaire en régime de force faible. Cela correspond généralement aux tout premiers stades de l'adhésion sur des substrats rigides avant que les structures d'adhésion ne deviennent matures. Nous avons développé une méthode quantitative, basée sur la calibration de la fluorescence, pour mesurer la densité d'intégrines-b1 dans les clusters adhésifs de cellules. Grâce à cette méthode, nous avons étudié l'évolution des clusters d'intégrines sur deux types de ligands liés à des SLBs : le peptide RGD très abondant dans les protéines de la matrice extracellulaire qui lie différents types d 'intégrines et la protéine Invasine, d'origine bactérienne, qui cible spécifiquement les intégrines-b1 avec une très forte affinité. Nous avons observé que les cellules adhèrent effectivement à ces surfaces et que des clusters d'intégrines se forment. Cependant, nous avons observé une dynamique d'adhésion cellulaire très différente sur les SLB fonctionnalisées par des RGD ou de l'Invasine (à la différence de leur adhésion sur du verre couvert des mêmes ligands). L'adhésion sur l'Invasine est décalée d'environ 45 minutes par rapport à celle sur RGD. Ce retard sur l'Invasine disparaît si les intégrines sont pré-activées par le Mn2+, ce qui suggère que l'activation des intégrines prend plus de temps sur l'Invasine, spécifique des intégrines-b1 malgré sa plus grande affinité. En moyenne, les clusters d'intégrines sont plus petits sur RGD que sur Invasine en termes de surface et de nombre de molécules. En outre, nous avons montré sur l'Invasine que les molécules de ligands sont redistribuées par les cellules, enrichies sous les clusters d'intégrines et complètement déplétées à d'autres endroits. Dans la phase t ardive de l'adhésion sur l'Invasine, nous avons observé que les cellules déformaient la membrane des SLBs et tiraient des tubes vers leur propre intérieur.

Adhesion is a ubiquitous phenomenon in the cellular world. It is the main means of interaction between cells and the external environment. These interactions are orchestrated by receptor molecules on the cell surface (among them, the integrins) and by about 200 adhesion proteins constituting the adhesome that connect the adhesion site (contact between the cell and the external substrate) to the cytoskeleton. The adhesome is a sensatory organ of the cell that allows it to “feel” the molecular composition or the rigidity of the substrate, by exerting forces on the substrates through a feedback process called mechanosensing. For example, cells can distinguish adhesive substrates coated with specialized ligands from non-adhesive ones coated with repellent molecules; they can also distinguish rigid substrates like glass from soft gels or even fluid membranes. These substrate properties can influence cell fate and behavior (from stem cell differentiation to cell m igration) through adhesion. We have studied cell adhesion on supported lipid bilayers (SLBs) functionalized with freely diffusing ligands. SLBs mimic cell membranes in the cell-cell interaction and their mechanical properties limit the range of forces cells can exert on them. Therefore, this system allows to study cell adhesion dynamics at low force regime. This generally corresponds to the very early stages of adhesion on rigid substrates before adhesion structures maturate. We have developed a quantitative method, based on fluorescence calibration, to measure b1-integrin densities in the adhesion clusters of adhering cells. Using this method, we have studied the evolution of integrin clusters on two types of ligands bound to the SLB: the RGD peptide very abundant in the proteins of the extracellular matrix that binds different types of integrins and the Invasin protein of bacterial origin that specifically targets b1-integrins with a very high affinity. We have found that cells adhere on these surfaces and that integrin clusters are formed. However, we have observed a very different dynamics of cell adhesion on SLBs coated with RGD or Invasin (as opposed to cell adhesion on glass coated with the same ligands). Adhesion on Invasin is delayed by about 45 minutes as compared to RGD. This delay is suppressed on Invasin after integrin priming with Mn2+, suggesting that integrin activation takes longer on the b1-specific Invasin in spite of its higher affinity. On average, integrin clusters on RGD are smaller in terms of area and number of molecules than on Invasin. Moreover, we showed on Invasin that the ligand molecules are redistributed by the cells, enriched under the integrin clusters and fully depleted in some other places. In the late stage of adhesion on Invasin, we have observed tether-like membrane deformations pulled out of the SLB and towards the cell interior.