Recherche de la cible de Retro-2 : une molécule inhibitrice du transport rétrograde et son amélioration pour l'application thérapeutique

Search for the target of Retro-2 : a retrograde transport inhibitor and its improvement for therapeutic application

• Auteur / Autrice : Livia Tepshi
• Direction : Daniel Gillet
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Inscription en doctorat le 26/09/2014; Soutenance le 21/11/2017
• Etablissement(s) : Paris, Muséum national d'histoire naturelle
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la nature et de l'Homme - Évolution et écologie (Paris)

Mots clés

Mots clés libres

Transport rétrograde

Retro-2

Toxine de Shiga

Syntaxin-5

Appareil de Golgi

Endosome précoce

Retrograde transport

Retro-2

Shiga toxin

Syntaxin-5

Golgi apparatus

Early endosome

Résumé

La molécule Retro-2 et son dérivé le plus actif, Retro-2.1, sont les premières molécules efficaces pour protéger contre la toxicité de la ricine et des toxines de Shiga in vitro et in vivo. Au cours de ce travail de thèse, nous avons réalisé un ensemble de travaux pour améliorer l’activité et la solubilité de Retro-2.1 et tenter de confirmer une cible potentielle de ces molécules identifiée par l’équipe de Ludger Johannes à l’Institut Curie. Ces travaux ont mis en jeu des techniques de marquage par photoaffinité, immunoprécipitation, digestion enzymatique et mesure d’interaction sur bio-senseur. Nous avons produit et purifié un fragment de cette protéine par voie recombinante et réalisé les premiers tests de cristallisation en présence de Retro-2.1. En parallèle, nous avons appliqué une technique d’identification de cible par triple hybride (procédé Hybrigenics). Des résultats préliminaires obtenus par la technique des ARN interférents (siRNA) suggèrent un rôle pour une autre protéine dans le transport rétrograde de la toxine de Shiga.

Retro-2 and its most active derivative, Retro-2.1, are the first efficient molecules to show protection against intoxication from ricin and Shiga toxin, both in vitro and in vivo. During the PhD, we tried to improve the solubility of Retro-2.1 and different techniques were used to validate a possible protein target of these molecules, identified by the research team of Ludger Johannes, at Curie Institute. During the validation process of the target candidate from Curie Institute and the research of new possible targets, different techniques were explored: photo-activation test with radiolabeled probes, immunoprecipitation, enzymatic digestion (DARTs) and measurement of interaction using a bio-sensor (BLItz). A fragment of the recombinant protein was expressed in E. coli and purified. The first screening of co-crystallization with Retro-2.1 were done. In parallel, we have applied another technique of target identification: the triple hybrid (Y3H). Preliminary results obtained using RNA interference technique (siRNA) suggest the importance of another protein in the retrograde transport of Shiga toxin.