Nanoscopie de fluorescence tri-dimensionnelle pour la biologie

Three-dimensional fluorescence nanoscopy for biology

• Auteur / Autrice : Nicolas Bourg
• Direction : Sandrine Lévêque-fort
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Optique et photonique
• Date : Inscription en doctorat le 03/09/2012
• Etablissement(s) : Université Paris-Saclay (ComUE)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Ondes et matière (Orsay, Essonne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut des Sciences Moléculaires d'Orsay
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Biophysique et Biophotonique
• Partenaire(s) de recherche : établissement de préparation de la thèse : Université Paris-Sud (1970-2019)

Mots clés

Mots clés libres

Microscopie

Optique

Biologie

Fluorescence

Super-résolution

Nanoscopie

Microscopy

Optics

Biology

Fluorescence

Super resolution

Nanoscopy

Résumé

En biologie cellulaire, la microscopie optique de fluorescence est un dispositif d'imagerie incontournable. Cependant la résolution d'un microscope optique de fluorescence est limitée par la diffraction. Celle-ci, principal défaut des microscopes optiques, empêche de différencier des détails dont la distance de séparation est inférieure à ~200-nm transversalement et ~600-nm axialement. Il est alors impossible d'observer des protéines individuelles situées dans le volume focal (~200-nm x ~200-nm x ~600-nm). Pour atteindre des résolutions spatiales significativement meilleures et passer de la microscopie à la nanoscopie (microscopie de super-résolution) de fluorescence, il faut mettre en oeuvre des stratégies qui s'appuient sur les propriétés photophysiques des fluorophores (Prix Nobel 2014), qui ne sont plus seulement de simples rapporteurs de position des entités cellulaires mais également la clé du gain en résolution. Dans ce cadre, différentes stratégies ont été développées : la nanoscopie à déplétion par émission stimulée (STED) et la nanoscopie par super-localisation de molécules uniques (SMLM). Ces travaux de thèse repose premièrement sur le développement et la mise en oeuvre de cette dernière stratégie qui est cependant super-résolue suivant les directions transverses de l'axe optique (la résolution suivant l'axe optique est toujours limitée par la diffraction). Pour améliorer la résolution axiale et mettre en oeuvre un dispositif nanoscopie 3D isotrope (résolution 3D ~15-nm), un module optique permettant de tirer profit de l'émission supercritique de fluorescence (SAF) a été développé et mise en oeuvre (voir Réf 1 et Réf 2). Ce nanoscope 3D isotrope a été employé afin d'améliorer nos connaissances sur les maladies neuro-dégénératives telles que la maladie d'Huntington (voir Réf 3) et d'Alzheimer (voir Réf 4) et sur la migration cellulaire des macrophages humains pouvant favoriser le développement de métastases lorsqu'ils pénètrent des tumeurs (voir Réf 5). Réf 1 : N. Bourg et al., Direct optical nanoscopy with axially localized detection, Nature Photonics, 2015 Réf 2 : P. Bon et al. (second auteur), Three dimensional nanometer localization of nanoparticles to enhance super-resolution microscopy, Nature Communications, 2015 Réf 3 : M-T. El Daher et al. (co-auteur), Huntingtin proteolysis causes toxicity through dynamin 1 dysregulation, EMBO Journal, 2015 Réf 4 : R. Daudin et al. (co-auteur), BIN1 overexpression modify key proteins involved in postsynaptic plasticity: analysis from a BIN1 mouse transgenic model and implication for LOAD pathophysiology, en rédaction Réf 5 : A. Proag et al. (co-auteur), Nanoscale architecture and mechanical function of adhesion complexes at podosomes, en rédaction, soumission à Nature cell biology prévue en novembre 2015

Fluorescence optical microscopy in an essential imaging tool for cellular biology. However, the spatial resolution of a fluorescence optical microscope is limited by diffraction. This, main flaw optical microscopes , prevents to differentiate details that the separation distance is less than ~200-nm transversally and ~600-nm axially. Then, it is impossible to distinguish individual proteins located in the focal volume (~200-nm x ~200-nm x ~600-nm). To achieve significantly better spatial resolutions and moving from fluorescence microscopy to fluorescence nanoscopy (super resolution microscopy), we must implement strategies that are based on the photophysical properties of the fluorophores (Nobel Prize of chemistry 2014) which are not only simple cellular entities position indicators but also the key to gain resolution. In this context, various strategies have been developed: stimulated emission depletion (STED) single molecule localization microscopy (SMLM). This thesis work is based primarily on the development and implementation of the latter strategy which is just super-resolved following the directions transverse to the optical axis (axial resolution still limited by diffraction). To improve the axial resolution and implement a 3D isotropic nanoscopy instrument (3D resolutio of ~15-nm), an optical module to take advantage of the supercritical angle fluorescence emission (SAF) has been developed and implemented (see Ref 1 and Ref 2). This 3D isotropic nanoscope was used to improve our understanding of neurodegenerative diseases such as Huntington's disease (see Ref 3) and Alzheimer disease (see Ref 4) and and cell migration of human macrophages can promote the development of metastases when entering tumors (see Ref 5). Ref 1 : N. Bourg et al., Direct optical nanoscopy with axially localized detection, Nature Photonics, 2015 Ref 2 : P. Bon et al. (second auteur), Three dimensional nanometer localization of nanoparticles to enhance super-resolution microscopy, Nature Communications, 2015 Ref 3 : M-T. El Daher et al. (co-auteur), Huntingtin proteolysis causes toxicity through dynamin 1 dysregulation, EMBO Journal, 2015 Ref 4 : R. Daudin et al. (co-auteur), BIN1 overexpression modify key proteins involved in postsynaptic plasticity: analysis from a BIN1 mouse transgenic model and implication for LOAD pathophysiology, en rédaction Ref 5 : A. Proag et al. (co-auteur), Nanoscale architecture and mechanical function of adhesion complexes at podosomes, en rédaction, soumission à Nature cell biology prévue en novembre 2015