Rôle et perturbation des hormones thyroïdiennes dans le cerveau : le xénope comme modèle d'étude de la perturbation de la disponibilité en hormone thyroïdienne pendant le développement précoce du cerveau

Thyroid hormone action and disruption in the brain : xenopus as a model to study disruption of thyroid hormone availability on early brain development

• Auteur / Autrice : Bilal Mughal
• Direction : Barbara Demeneix, Jean-Baptiste Fini
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Inscription en doctorat le 24/01/2014; Soutenance le 27/09/2017
• Etablissement(s) : Paris, Muséum national d'histoire naturelle
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la nature et de l'Homme - Évolution et écologie (Paris ; 1995-....)

Mots clés

Mots clés libres

Endocrinologie

Neuro développement

Xenopus

Perturbateur endocrinien

Hormone thyroïdienne

Mct8

Endocrinology

Neurodevelopment

Xenopus

Endocrine disruption

Thyroid hormone

Mct8

Résumé

Les hormones thyroïdiennes (HT) sont essentielles au développement normal du cerveau chez les vertébrés. La perturbation des HT, par des facteurs génétiques et/ou environnementaux, est corrélée à des défauts neuro-développementaux (autisme, troubles de l'hyperactivité) et une perte de QI. En moyenne, 30 produits chimiques d'origine humaine, dont 15 omniprésents, sont présents chez toutes les femmes américaines, y compris enceintes. Beaucoup de ces produits sont des perturbateurs thyroïdiens démontrés ou soupçonnés. Un mélange représentatif de ces 15 produits chimiques a été établi à des concentrations relevées dans le liquide amniotique humain. Un test transcriptionnel permettant de révéler la perturbation des HTs avec une mesure de fluorescence (GFP) a été utilisé. Des effets dose-dépendants, conséquents à l'exposition à court terme (72h) aux produits chimiques seuls ou en mélange, ont été mesurés. L'analyse des cerveaux a montré des changements significatifs dans l'expression de gènes liés à la signalisation des HT (récepteurs, désiodases et marqueurs de différenciation neurale). Une analyse immunohistochimique a confirmé que l'exposition au mélange affecte la prolifération des neurones ainsi que la taille des neurones et des oligodendrocytes. Les têtards exposés aux mélanges sont également moins mobiles. Comme la signalisation en HT est fortement conservée au sein des vertébrés, ces résultats suggèrent que des mélanges chimiques omniprésents pourraient avoir des effets néfastes sur le développement foetal humain. La perturbation génétique des HTs est évidente dans le syndrome d'Allan Herndon-Dudley (AHD) où, chez les humains, la mutation du transporteur aux HT (THT) monocarboxylate 8 (MCT8), entraîne une grave déficience intellectuelle. L'absence de phénotype neurologique chez les souris invalidées pour ce gène, a conduit à la génération de différents modèles non-rongeurs. Le mct8 de Xénope et d'autres THT d'intérêt ont été clonés et caractérisés. L'alignement des protéines et l'analyse bootstrap ont montré que le mct8 de Xénope est plus proche de son orthologue mammifère que de ses homologues téléostéens. Un essai cellulaire in vitro d'absorption d'hormones radiomarquées a confirmé le transport actif, bidirectionnel par le mct8 de xénope, de la T3 et de la T4. Pour les précurseurs des HT, la diiodotyrosine (DIT) et la monoiodotyrosine (MIT), ont été montrées activement transportées hors des cellules. En utilisant la PCR quantitative en temps réel (RT-qPCR) et l'hybridation in situ, une expression spécifique du mct8 de xénope, croissante en fonction du développement, a été observée dans le cerveau. En conclusion, ces résultats montrent que les THT de xénope sont fonctionnels et ont des profils d'expression spatio-temporels marqués. Ces fonctionnalités en font des cibles intéressantes pour élucider leurs rôles dans la détermination de la disponibilité en HT pendant le développement embryonnaire. Le Xénope laevis a été utilisé comme modèle dans ces expériences. X. laevis est idéal pour étudier la signalisation des HT en raison de sa métamorphose dépendante d'un pic en hormones thyroïdiennes, pic ayant lieu à la naissance chez l'Homme. En outre, X. laevis est un modèle de référence pour l'étude de l'embryogenèse et la biologie du développement des vertébrés. Les gènes de ménage sont essentiels pour l'analyse de l'expression génique lors de l'utilisation de RT-qPCR, or il manque des gènes de ménage ad hoc pour X. laevis. En utilisant des données RNA-seq précédemment publiées sur différents stades de X. laevis, 14 principaux gènes candidats ont été identifiés en fonction de leurs niveau d'expression, du stade de développement et du degré de variation. En utilisant la RT-qPCR, la stabilité de ces gènes a été évaluée et des combinaisons de paires de gènes de référence ont été optimisées pour l'étude 1/du développement 2/du cerveau pendant la méyamorphose et 3/de la perturbation thyroïdienne.

Thyroid hormones (TH) are essential for normal brain development in vertebrates. Disruption of TH action, either due to genetic and/or environmental factors, has been implicated in neurological defects such as autism, attention deficit hyperactivity disorders (ADHD) and IQ loss. On average, over 30 anthropogenic chemicals are present in all Amrican women, with 15 being ubiquitous, including in pregnant women. Many of these chemicals are demonstrated or suspected TH disruptors. A representative mixture of these 15 common chemicals was established at concentrations reported in human amniotic fluid and an in vivo larval reporter (GFP) assay was used to determine integrated TH transcriptional responses. Dose-dependent effects of short-term (72h) exposure to single chemicals and the mixture were found. Gene expression analysis on dissected brains showed significant changes in TH related genes including receptors, deiodinases and neural differentiation markers. Immunohistochemistry confirmed the mixture exposure action on neural proliferation as well as neuron and oligodendrocyte size. Mixture exposed tadpoles also displayed dose-dependent reductions in mobility. As TH signalling is strongly conserved across vertebrates these results suggest that ubiquitous chemical mixtures could be exerting adverse effects on foetal human brain development. Genetic disruption is also evident in the Allan Herndon-Dudley (AHD) syndrome where, in humans, the mutation of the brain specific TH transporter (THT), monocarboxylate transporter 8 (MCT8), leads to severe intellctual disability. The lack of neurological phenotype in mice model of Mct8 deficiency has driven the need for characterisation and generation of various non-rodent models. The Xenopus mct8 and additional TH transporters of interest were cloned and characterised. Protein alignment and bootstrap analysis showed that Xenopus mct8 is closer to its mammalian orthologue than its teleost counterparts. Radiolabelled hormones in vitro uptake assay confirmed Xenopus mct8 active transport of both T3 and T4 bi-directionally. As to the thyroid precursor molecules, diiodotyrosine (DIT) and monoiodotyrosine (MIT), both human and Xenopus mct8, showed active efflux, but no influx. Using real-time quantitative PCR (RT-qPCR) and in situ hybridization, specific expression of the mct8 was observed in the brain, with increasingly strong expression as development progressed. Using the before mentioned in vitro assay, effects of common environmental xenobiotics on MCT8 function were assessed. In conclusion, these results show that Xenopus TH transporters are functional and display marked spatio temporal expression patterns. These features make them interesting targets to elucidate their roles in determining TH availability during embryonic development. Xenopus laevis was used a model of choice in these experiments. X. laevis is ideal for studying TH signalling due to its thyroid dependent metamorphosis, a stage comparable to birth in humans. Further, X. laevis is a popular amphibian model for studying vertebrate embryognesis and development. Reference genes are essential for gene expression analysis when using RT-qPCR, and there is a lack of ad hoc reference genes for X. laevis. Using previously published RNA-seq data on different X. laevis stages, top 14 candidate gene were identified with respect to their expression levels as a function of developmntal stage and degree of variation. Using RT-qPCR, the stability of these genes was evaluated and optimized reference gene pair combinations established for studying 1/development (early whole embryos), 2/brains at later stages (metamorphosis and adult), and 3/thyroid signalling.