Étude du rôle du transporteur de phosphate inorganique PiT1/SLC20A1 dans l'inflammation

Novel function of PiT1/SLC20A1 in LPS-related inflammation and wound healing

• Auteur / Autrice : Eugénie Koumakis
• Direction : Gérard Friedlander
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire
• Date : Soutenance le 25/11/2016
• Etablissement(s) : Sorbonne Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Necker Enfants-Malades (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement de préparation : Université Paris Descartes (1970-2019)
• Jury : Président / Présidente : Frédéric Batteux
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Gilles Chiocchia, Jamel El Benna
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Jean-Claude Dussaule, Francis Berenbaum

Mots clés

Mots clés contrôlés

Facteur de transcription Pit-1

Facteur de transcription NF-kappa B

Protéines de transport du phosphate

Facteur de transcription NF-κB

Inflammation

Mots clés libres

Phosphate

Inflammation

NF-κB

Résumé

PiT1/SLC20A1 est un transporteur de phosphate inorganique couplé au gradient de sodium exprimé de manière ubiquitaire. Outre son rôle de transporteur de phosphate bien décrit, la protéine PiT1 possède d’autres fonctions biologiques indépendantes de sa fonction de transport. L’équipe a ainsi montré que PiT1 jouait un rôle au cours de la prolifération cellulaire (Beck et al., JBC 2009), de l’apoptose induite par le TNFα (Salaun et al., JBC 2010), de l’érythropoièse (Forand et al., Blood 2013), et du développement hépatique (Beck et al., Plos One 2010). L’objectif de ce travail a été d’évaluer le rôle de PiT1 dans l’inflammation, initialement dans un modèle murin d’inflammation hépatique de bas grade provoquée par un régime riche en fructose et en lipides (High Fat Diet, HFD), puis en se focalisant sur la réponse macrophagique induite par le lipopolysaccharide (LPS). L’invalidation spécifique de PiT1 dans les hépatocytes (modèle murin Alb-Cre;Pit1lox/lox) protège les souris de l’accumulation de tissu adipeux et de l’inflammation hépatique induite par un régime HFD. De plus, l’expression de F4/80 est plus faible dans le foie de souris transgéniques que dans celui des souris WT, suggérant un infiltrat macrophagique moins important dans le foie de ces souris, ce qui est corrélé à une moindre augmentation de l’expression hépatique de MCP1, chemokine jouant un rôle déterminant dans le recrutement de monocytes/macrophages. Les macrophages étant la principale source de cytokines et chemokines, nous nous sommes par la suite intéressés au rôle de PiT1 dans la réponse inflammatoire macrophagique. Après stimulation par le LPS, la production de cytokines et de chemokines pro-inflammatoires (MCP-1, IL-6, TNFα) est plus faible dans des cultures primaires de macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDM) déficients en PiT1, issus du modèle murin Mx1-Cre;Pit1lox/lox. De façon concordante, des taux plus faibles de MCP-1 et d’IL-6 ont été observés in vivo dans le sérum de souris Mx1-Cre;Pit1lox/lox injectées avec du LPS 24h avant sacrifice, en comparaison à des souris Pit1lox/lox. La diminution de production de MCP-1 dans des BMDM déficients en PiT1 est corrélée à une diminution des capacités de migration de macrophages in vitro. Des taux plus faibles de ROS (H2O2) ont également été mesurés in vitro dans des macrophages déficients en PiT1 en comparaison à des macrophages WT. Parallèlement, l’étude de la modulation de PiT1 par le LPS et par la voie NF-κB a révélé que l’expression de PiT1 (ARNm et protéine) est induite par le LPS, de manière dose-dépendante. L’étude de la régulation du promoteur de Pit1 a montré une augmentation de l’activité du promoteur en présence de NF-κB, alors que le facteur de transcription AP1 est sans effet. De plus, l’adjonction d’un inhibiteur pharmacologique de NF-κB, le BAY11-7082, abolit l’augmentation de l’expression de PiT1 induite par le LPS in vitro. Enfin, des expériences d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) démontrent que l’augmentation de l’expression de PiT1 induite par NF-κB est due à la liaison directe de p65 à son promoteur. Dans l’ensemble, ces résultats démontrent une nouvelle fonction biologique de PiT1 dans la réponse inflammatoire macrophagique et dans l’amplification de celle-ci puisque PiT1 est identifié ici comme cible directe du facteur de transcription NF-κB.

PiT1/SLC20A1 is an inorganic phosphate transporter with additional functions including the regulation of TNFα-induced apoptosis, erythropoiesis, cell proliferation and insulin signaling. Recent data suggest a relationship between PiT1 and NF-κB-dependent inflammation: (i) Pit1 mRNA is up-regulated in the context of NF-κB pathway activation; (ii) NF-κB target gene transcription is decreased in PiT1-deficient conditions. This led us to investigate the role of PiT1 in lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation. MCP-1 and IL-6 concentrations were impaired in PiT1-deficient bone marrow derived macrophages (BMDMs) upon LPS stimulation. Lower MCP-1 and IL-6 serum levels were observed in Mx1-Cre; Pit1lox/lox mice dosed intraperitoneally with LPS. Lower PiT1 expression correlated with decreased in vitro wound healing and lower reactive oxygen species levels. Reduced IκB degradation and lower p65 nuclear translocation were observed in PiT1-deficient cells stimulated with LPS. Conversely, PiT1 expression was induced in vitro upon LPS stimulation. Addition of an NF-κB inhibitor abolished LPS-induced PiT1 expression. Furthermore, we showed that p65 expression activated Pit1 promoter activity. Finally, ChIP assays demonstrated that p65 directly binds to the mPit1 promoter in response to LPS. These data demonstrate a completely novel function of PiT1 in the response to LPS and provide mechanistic insights into the regulation of PiT1 expression by NF-κB.