Exploration des mécanismes de résistance du VHB à l'entécavir avec une approche phénotypique

Mechanisms of HBV resistance to entecavir explored using a phenotypic approach

• Auteur / Autrice : Julien Marlet
• Direction : Catherine Gaudy-Graffin, Denys Brand
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 18/12/2020
• Etablissement(s) : Tours
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant (Centre-Val de Loire ; 2012-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Morphogénèse et Antigénicité du VIH et des Virus des Hépatites
• Jury : Président / Présidente : Berthe-Marie Imbert-Marcille
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Slim Fourati, Antoine Touzé
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Patrick Soussan, Véronique Loustaud-Ratti

Mots clés

Mots clés contrôlés

Transcriptase inverse

Génotype

Déterminants antigéniques

Microorganismes -- Mutation

Patients -- Coopération

Phénotype

Entecavir

Résistance aux médicaments

Virus de l'hépatite B

Mots clés libres

Hépatite B

Antiviral

Mutation rt250L

Antiviral

Phenotypic

Hepatitis B

Genotypic

Entecavir

Resistance

Résumé

L’exploration des échecs de traitement par entécavir des hépatites B chroniques repose sur l’évaluation de l’observance thérapeutique et sur la recherche de mutations de résistance dans le domaine polymérase/transcriptase inverse (Pol/RT) du VHB (Lampertico et al., 2017). Chez certains patients, cet examen n’est pas informatif car il ne permet pas de détecter de mutation de résistance connue à l’entécavir. Nous avons émis l’hypothèse que ces situations d’échecs inexpliqués de traitement à l’entécavir pourraient être associées à de nouveaux mécanismes de résistance, identifiables par des approches phénotypiques.Dans la première partie de ce travail, nous avons développé une approche transversale d’analyse de la résistance combinant des tests génotypiques, phénotypiques et un suivi pharmacologique. Cette approche a été appliquée à 9 patients en échec de traitement par entécavir et infectés par des isolats de sensibilité diminuée à cet antiviral. L’approche phénotypique a permis de montrer dans ce contexte que la mutation rt250L suffisait à conférer une résistance l’entécavir in vitro et in vivo, tandis que la mutation rt173L n’avait pas d’impact sur le niveau de résistance (Marlet et al., 2020). Ces résultats contribueront à la réévaluation des recommandations d’interprétation du génotypage de résistance du VHB.La seconde partie de ce travail visait à explorer les mécanismes impliqués dans les échecs de traitement par entécavir en l’absence de mutation de résistance détectable dans le domaine Pol/RT. Cette étude a porté sur 3 patients en réponse virologique partielle à l’entécavir après réactivation du VHB dans le cadre d’un traitement immunosuppresseur. Chez ces patients, les mutations sélectionnées sur l’ensemble du génome du VHB avant et pendant le traitement par entécavir ont été recherchées par séquençage profond. Chez deux patients, des mutations d’échappement au système immunitaire ont été sélectionnées avant traitement dans l’Ag HBs. Chez un troisième patient, deux mutations ont été sélectionnées durant le traitement par entécavir dans des domaines associés à la réponse immunitaire (Q120K, pre-S2) et à la morphogenèse (Q206K, Core), sans conférer de résistance. Ces mutations en dehors du domaine Pol/RT pourraient avoir contribué indirectement à la réponse virologique partielle, notamment par échappement à la réponse immunitaire déjà déficiente chez ces patients immunodéprimés. Ces résultats suggèrent que la recherche et la caractérisation phénotypique de mutations sélectionnées en dehors du domaine Pol/RT pourraient permettre de mieux comprendre les mécanismes de réponse virologique partielle à l’entécavir.

Treatment adaptation after hepatitis B virus (HBV) entecavir treatment failure relies on evaluation of patient adherence to treatment and identification of resistance mutations by sequencing of the polymerase/reverse transcriptase domain (Pol/RT) (Lampertico et al., 2017). In a subset of patients, these mutations are not detected and treatment failure remains unexplained. We hypothesized that these observed discrepancies may be linked to other mechanisms of resistance, which can be detected with an integrative approach, based on a phenotypic resistance assay.In the first part of this work, this approach was retrospectively applied to nine clinical isolates associated with entecavir treatment failure and harboring mutations conferring a reduced susceptibility to entecavir. Mutation rt250L, but not rt173L, was associated with resistance to entecavir in vitro and in vivo, even in the absence of other entecavir resistance mutations (Marlet et al., 2020). These results will be useful for future update of genotypic drug resistance testing guidelines.In the second part of this work, we aimed to explore the mechanisms associated with entecavir treatment failure in the absence of detectable resistance mutations by Pol/RT Sanger sequencing. Using deep sequencing, we retrospectively explored the whole HBV genome of three clinical isolates associated with partial virological response to entecavir in immunocompromised patients. HBs Ag immune escape mutations were selected before treatment in two patients. In a third, mutations were selected during entecavir treatment in domains associated with immune response (Q120K, pre-S2) and morphogenesis (Q206K, Core), without conferring any resistance to entecavir. We hypothesized that these mutations could increase the risk of partial virological response to entecavir by an immune escape mechanism, especially in immunocompromised patients. Identification and characterization of mutations selected outside of the Pol/RT domain during entecavir treatment could be useful for a better understanding of viral factors associated with partial virological response to entecavir.