Développement de système sans clonage à haut débit pour l'expression mammifère d'anticorps natifs

Development of high throughput cloning-free systems for mammalian expression of natively paired VH : VL antibody repertoires

• Auteur / Autrice : Antoine Millereau
• Direction : Andrew Griffiths, Emmanuelle Vigne
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie Physique
• Date : Soutenance le 12/12/2022
• Etablissement(s) : Université Paris sciences et lettres
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Chimie physique et chimie analytique de Paris Centre
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Chimie, Biologie, Innovation (Paris)
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Laboratoire de biochimie (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Ecole supérieure de physique et de chimie industrielles de la Ville de Paris (1882-....)
• Partenaire(s) de recherche : Entreprise : Sanofi (2004-....)
• Jury : Président / Présidente : Anke Lindner
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Andrew Griffiths, Emmanuelle Vigne, Klaus Eyer, Michaël Ryckelynck
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Klaus Eyer, Michaël Ryckelynck

Mots clés

Mots clés libres

Anticorps monoclonaux

Transfection

Insertion génomique

Expression mammifère

Haut débit

Clonage

Monoclonal antibodies

Transfection

Genomic insertion

Mammalian expression

High throughput

Cloning free

Résumé

La production d’anticorps induite par la réponse humorale est une composante clé de la réponse immunitaire de l’organisme. Cependant, cette sécrétion d’anticorps par les lymphocytes B n’est pas toujours suffisante pour détruire le pathogène, notamment dans le cas de tumeurs. Il existe donc un intérêt majeur pour la recherche et le développement de l’immunothérapie et plus particulièrement d’anticorps spécifiques capables d’apporter une meilleure réponse thérapeutique. Dans ce contexte, les anticorps monoclonaux (mAbs), de par leur affinité et leur liaison spécifique aux antigènes (Ags), apparaissent comme des recours thérapeutiques puissants.Les progrès des technologies de découverte d'anticorps, associés aux innovations en matière de séquençage de l'ADN de nouvelle génération ont permis la génération de milliers d'anticorps monoclonaux (mAbs) dans le cadre de campagnes de découverte d'anticorps. Les processus à haut débit (HTP) génèrent un grand nombre d'anticorps dans un délai rapide pour le criblage et la sélection. Cependant, ces tests préliminaires sont généralement basés uniquement sur la liaison et non sur l'activité souhaitée de l'anticorps, qui n’a souvent pas le format final désiré.Plus tard, au cours du projet de découverte d'anticorps, les mAbs sélectionnés sont souvent exprimés sous diverses formes (Fab, IgG, multispécifiques, etc…) pour correspondre au mode d'action souhaité, en utilisant des procédés HTP supplémentaires pour permettre l'expression à petite échelle de milliers de mAbs. Cela passe par le clonage moléculaire de leurs séquences de domaines variables lourds (VH) et légers (VL) dans des vecteurs d'expression. Ces derniers sont ensuite transfectés de manière transitoire dans des cellules mammifères pour le criblage dans le format final et sélectionnés pour une production à petite échelle. Le clonage de gènes à domaine variable amplifiés par PCR ou synthétiques dans un vecteur d'expression nécessite généralement une croissance en plaques de gélose et le criblage de plusieurs clones contenant l'insert désiré. La plupart de ces protocoles souffrent du prélèvement de colonies et des exigences du séquençage, le taux de clonage incorrect restant de 5 à 10 %. L'ensemencement de centaines de transformations bactériennes sur plaques de gélose et le criblage de plusieurs colonies à partir de chaque plaque prennent énormément de temps et ont un faible rendement. Par conséquent, le nombre d'anticorps pouvant être clonés et exprimés à l'aide de ces méthodes est limité.Il existe donc un besoin non satisfait d'un système efficace, rapide et sans clonage, pour reformater et exprimer un grand nombre (des dizaines de milliers) de mAbs sélectionnés en vue de leur expression dans des cellules mammifères dans le format correct pour le mode d'action souhaité.Cette thèse s’intéresse au développement de deux systèmes haut débit permettant l’expression, sans clonage, chez les mammifères de répertoires de paires VH:VL d’anticorps natifs. Le premier système développé permet de remplacer l’étape limitante de clonage à travers l’utilisation de techniques de biologie moléculaire. En plus de cela, le second vise une insertion unique au génome des cellules transfectées permettant l’expression, sur demande, de mAb humanisés de ces mêmes répertoires. Ce système est basé sur la production d’un vecteur d’expression bicistronique pour chaque mAb et de son insertion unique au génome d’une cellule CHO grâce à un système d’intégration attP-attB. Cette thèse a permis d’arriver aux preuves de concept de fonctionnement de ces deux systèmes, permettant d’envisager une simplification du processus de reformatage et d’expressions de mAbs d’un côté et, l’expression sur demande par des cellules CHO de chacun des anticorps provenant d’un répertoire de paires VH:VL. Cela pourrait notamment s’appliquer à l’ « immortalisation » d’une population de cellules B en générant une population de cellules CHO stables produisant exactement les mêmes anticorps.

The production of antibodies induced by the humoral response is a key component of the body's immune response. However, this secretion of antibodies by B lymphocytes is not always sufficient to destroy the pathogen, especially in the case of tumors. There is therefore a major interest in the research and development of immunotherapy and more particularly of specific antibodies capable of providing a better therapeutic response. In this context, monoclonal antibodies (mAbs), due to their affinity and specific binding to antigens (Ags), appear as powerful therapeutic tools.Advances in antibody discovery technologies, coupled with innovations in next-generation DNA sequencing have enabled the generation of thousands of monoclonal antibodies (mAbs) in antibody discovery campaigns. High-throughput (HTP) processes generate large numbers of antibodies in a rapid timeframe for screening and selection. However, initial screening and selection is usually based only on binding and not on the desired activity of the antibody, which often does not have the expected final format for end use.Later in the course of the antibody discovery project, mAbs hits are often converted into various formats (Fab, IgG, multispecific, etc...) to fit with the mode of action of interest, using additional HTP processes to enable small-scale expression of thousands of mAbs. This involves molecular cloning of their heavy and light variable (VH and VL) domain sequences into expression vectors. These are then transiently transfected into mammalian cells for screening in the final format and selected for small-scale production. Cloning PCR-amplified or synthetic variable domain genes into an expression vector typically requires growth in agar plates and screening of multiple clones containing the insert of interest. Most of these protocols suffer from colony picking and sequencing requirements, as incorrect cloning rate remains at 5-10%. Plating hundreds of bacterial transformations on agar plates and screening multiple colonies from each plate is time consuming and low throughput. Therefore, the number of antibodies that can be cloned and expressed using these methods is limited.Thus, there is an unmet need for an efficient, rapid and cost-effective cloning-free system to reformat and express large numbers (tens of thousands) of mAbs hits for expression in mammalian cells in the correct format for the mode of action of interest.This PhD project focuses on the development of two high-throughput cloning-free systems for mammalian expression of natively paired VH:VL antibody repertoires. The first system developed allows to replace the limiting step of cloning through the use of molecular biology techniques. In addition to that, the second system aims at a unique insertion into the genome of the transfected cells allowing the expression, on demand, of humanized mAbs of these same repertoires. This system is based on the production of a bicistronic expression vector for each mAb and its unique insertion into the genome of a CHO cell thanks to an attP-attB integration system. This thesis lead to the proof of concept for these two systems, permitting to consider a simplification of the process of reformatting and expression of mAbs on one hand, and on demand expression by CHO cells of each antibody coming from a repertoire of VH:VL pairs. This could be applied in particular to the "immortalization" of a B cell population by generating a population of stable CHO cells producing exactly the same antibodies.