Détection et quantification des ADN non intégrés linéaires responsables de la latence pré-intégrative du VIH-1

Detection and quantification of the unintegrated linear DNA responsible for the preintegrative latency of HIV-1

• Auteur / Autrice : Hélène Roux
• Direction : Jacques Dutrieux
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie
• Date : Soutenance le 21/01/2022
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Cochin (Paris ; 2002-....)
• Jury : Président / Présidente : Florence Margottin-Goguet
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Florence Margottin-Goguet, Vincent Parissi, Lucie Etienne, Fabrizio Mammano, Francesca Di-Nunzio
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Vincent Parissi, Lucie Etienne

Mots clés

Mots clés contrôlés

Inhibiteurs de l'intégrase du VIH

Infections à VIH

Mots clés libres

VIH

Latence pré-intégrative

ADN linéaire non intégré

HIV

Pre-integrative latency

Unintegrated linear DNA

Résumé

L'un des défis actuels de la recherche sur l'infection à VIH demeure la compréhension des mécanismes de latence virale. La latence est la cause de la chronicité de l'infection et entraîne un rebond viral inéluctable lors de l'arrêt des traitements antirétroviraux. Cependant, la contribution de la latence pré-intégrative dans ce phénomène reste peu explorée. Notre hypothèse de travail découle de l'observation de la diminution de la charge virale chez les patients traités par antirétroviraux. En effet, chez les patients traités sans inhibiteur de l'intégrase, la diminution de la charge virale suit deux phases : une première, très rapide, due à la demi-vie courte des cellules productrices de virus, et une seconde, nettement plus longue, dont les causes n'ont pas été démontrées. Cette seconde phase est absente chez les patients traités avec un inhibiteur de l'intégrase. Nous émettons donc l'hypothèse qu'avant l'initiation du traitement, une proportion de cellules infectées héberge une ou plusieurs copies d'ADN linéaire non intégré (ULD) dont l'intégration progressive serait responsable de la seconde phase de décroissance de la charge virale. Mon travail de thèse a porté sur la dynamique de la latence pré-intégrative à la fois in vitro et in vivo. Ainsi, mon premier objectif a été de développer une nouvelle technologie permettant de quantifier sensiblement et spécifiquement les ULD. Cette technologie, appelée DUSQ (DNA Ultra-Sensitive Quantification), est basée sur deux techniques : la Linker-Mediated PCR et le Next Generation Sequencing. Je me suis ensuite intéressée à la dynamique des ULD in vitro et in vivo. J'ai ainsi pu démontrer que ces ULD avaient une demi-vie nettement plus importante que ce qui était présumé dans la littérature : de 0,6 jours dans une lignée lymphoïde (MT4-R5), de 2,9 jours dans des Macrophages Dérivés de Monocytes, et de 9,9 jours dans des lymphocytes T CD4+ quiescents. Enfin, in vivo dans des prélèvements issus de patients chroniquement infectés par le VIH-1, j'ai pu détecter et quantifier des ULD (jusqu'à 250 copies d'ULD/105 cellules) qui n'étaient pas détectables par les techniques conventionnelles existantes. L'étude de l'existence des ULD et de leur relative stabilité dans certains types cellulaires pourrait aider à répondre à certaines questions encore non élucidées sur les étapes précoces du cycle viral, comme l'intégrité de la capside, ou encore l'import nucléaire. De plus, comprendre les paramètres influençant la dynamique des ULD permettrais de placer la latence pré-intégrative comme un élément non négligeable de la persistance virale. Sa prise en compte serait donc pertinente lors du développement de nouvelles stratégies d'éradication du réservoir, le développement de nouvelles thérapies antirétrovirales et leur utilisation dans des protocoles de prophylaxie pré-exposition.

One of the current challenges in HIV research is the understanding of the mechanisms of viral latency. Latency causes the chronicity of the infection and leads to an inevitable viral rebound when antiretroviral treatments are stopped. However, the contribution of pre-integrative latency to this phenomenon is still poorly explored. Our hypothesis stems from the observation of the decrease in viral load in patients treated with antiretroviral drugs. Indeed, in patients treated without integrase inhibitors, the decrease in viral load occurs in two phases: a first phase, very rapid, due to the short half-life of virus-producing cells, and a second phase, much longer, the causes of which have not been demonstrated. This second phase is absent in patients treated with integrase inhibitors. We therefore hypothesize that prior to the initiation of treatment, a proportion of infected cells harbor one or more copies of unintegrated linear DNA (ULD) whose progressive and slow integration would be responsible for the second phase. My thesis work was about the dynamics of pre-integrative latency in vitro and in vivo. Thus, my first objective was to develop a new technology to quantify the ULDs sensitively and specifically. This technology, called DUSQ (DNA Ultra-Sensitive Quantification) is bases on two techniques: Linker-Mediated PCR and Next Generation Sequencing. I then focused on the dynamics of ULDs in vitro and in vivo. I was able to demonstrate that the ULDs have a much higher half-life than what was presumed in the literature: 0,6 days in a lymphoid cell line (MT4-R5), 2,9 days in Monocyte Derived Macrophages, and 9,9 days in resting CD4+ T lymphocytes. Finally, in vivo, in samples from patients chronically infected with HIV-1, I was able to detect and quantify ULDs (up to 250 copies/105 cells) which were not detectable using conventional, preexisting techniques. Studying the existence of ULDs and their relative stability in certain cell types could help to elucidate some still unanswered questions about the early stages of the viral cycle, such as capsid integrity, or nuclear import. Moreover, understanding the dynamic of ULDs would allow us to place pre-integrative latency as a parameter involved in viral persistence. It would therefore be relevant to take them into account for the development of new eradication strategies and new antiretroviral therapies, and for the design of pre-exposure prophylaxis protocols.