Exploration de la diversité et de la fidélité cellulaires dans la régénération des membres de crustacés à l'aide du séquençage de l'ARN mononucléaire

Exploring cell diversity and fidelity in crustacean limb regeneration using single-nucleus RNA sequencing

• Auteur / Autrice : Alba Almazan Almazan
• Direction : Michalis Averof
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 12/12/2022
• Etablissement(s) : Lyon, École normale supérieure
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale de Biologie Moléculaire Intégrative et Cellulaire (Lyon)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de Génomique Fonctionnelle de Lyon (Lyon ; 2007-....)
• Jury : Président / Présidente : Marie Delattre
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Michalis Averof, Marie Delattre, Evelyn Houliston, Jordi Solana, Nikolaos Konstantinides, Mathilde Paris
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Evelyn Houliston, Jordi Solana

Mots clés

Mots clés contrôlés

Séquençage des acides nucléiques

Crustacés

Régénération (biologie)

Mots clés libres

Parhyale hawaiensis

Régéneration

Séquençage de l'ARN mononucléaire

Parhyale hawaiensis

Regeneration

Single-nucleus RNA sequencing

Résumé

La capacité à régénérer des parties du corps blessées ou amputées est très répandue dans le règne animal. Les espèces hautement régénératrices peuvent restaurer des organes aux architectures complexes et aux multiples types de cellules différenciées, comme des appendices externes, des organes internes ou, dans certains cas, le corps entier à partir de minuscules fragments de tissus. Les technologies de séquençage de cellules uniques ont ouvert une nouvelle voie pour répondre à l’échelle unicellulaire aux anciennes questions sur la composition et la dynamique cellulaires des tissus en régénération. Au cours de ma thèse, j'ai mis en œuvre cette méthode dans le système modèle émergent Parhyale hawaiensis afin d’établir le catalogue des types de cellules présentes dans les membres et d'évaluer la fidélité de la régénération. Les membres de Parhyale hawaiensis sont des tissus petits mais complexes entourés d'une cuticule imperméable, qui représente un obstacle à l'extraction de cellules intactes. Après plusieurs essais et optimisations, j'ai mis en place une approche de séquençage de l'ARN mononucléaire (snRNA-seq), qui diminue le biais de récupération de populations cellulaires hétérogènes par rapport aux méthodes unicellulaires. Le séquençage du transcriptome nucléaire de membres intacts m'a permis d'identifier des groupes distincts de noyaux, sur la base de leur profil transcriptionnel, reflétant une diversité de types cellulaires putatifs. La comparaison de données provenant de membres indemnes et régénérés après amputation a révélé que la diversité et les proportions des types de cellules sont fidèlement restaurées pendant la régénération. De plus, j’ai mis en évidence un groupe de cellules distinct avec une forte signature liée au cycle de la mue. Ces travaux posent les bases de l'exploration des trajectoires cellulaires au cours de la régénération à l'aide du snRNA-seq, de la caractérisation de leur dynamique et de l'identification des cellules progénitrices.

The ability to regenerate injured or amputated body parts is widespread in the animal kingdom. Highly regenerative species can restore organs with complex architectures and multiple differentiated cell types, such as external appendages, internal organs or, in some cases, the entire body from tiny tissue fragments. Single-cell sequencing technologies have opened a new way to answer old questions on the cellular composition and dynamics of regenerating tissues at single-cell resolution. During my thesis, I implemented this method in the emerging model system Parhyale hawaiensis to investigate the catalog of cell types found within the legs and to assess the fidelity of regeneration. Pahryale legs are small but complex tissues surrounded by an impermeable cuticle, which presents a challenge for extracting intact cells. After several trials and optimization, I established a single-nucleus RNA sequencing (snRNA-seq) approach, which diminishes the bias in recovering heterogeneous cell populations compared with single-cell methods. Sequencing the nuclear transcriptome of intact limbs allowed me to identify distinct clusters of nuclei, based on their transcriptional profile, reflecting a diversity of putative cell types. The comparison of datasets from uninjured and post-regenerated limbs revealed that the diversity and proportions of the cell types are faithfully restored during regeneration. Additionally, these datasets revealed a distinct cluster with a strong signature related to the molting cycle. This work establishes the basis for exploring the cell trajectories during regeneration using snRNA-seq, characterizing their dynamics and identifying the progenitor cells.