Étude de la fonction des protéines MBNL au cours du développement à l’aide de cellules souches humaines induites à la pluripotence

Study of the function of MBNL proteins during development using human induced pluripotent stem cells

• Auteur / Autrice : Antoine Merien
• Direction : Cécile Martinat
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Physiologie, physiopathologie
• Date : Soutenance le 24/03/2021
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut des Cellules Souches pour le Traitement et l’Etude des maladies Monogéniques (Evry, Essonne) - Centre d'Etude des Cellules Souches / CECS
• Partenaire(s) de recherche : référent : Université d'Évry-Val-d'Essonne (1991-....)
• Jury : Président / Présidente : Laurent Schaeffer
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Marc Bitoun, Geneviève Gourdon, Mario Amendola
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Marc Bitoun, Didier Auboeuf

Mots clés

Mots clés contrôlés

Myocytes

Épissage alternatif

Dystrophie myotonique

Cellules souches pluripotentes induites

CRISPR-Cas9

Mots clés libres

Dystrophie myotonique de type 1

CRISPR/Cas9

Cellules souches pluripotentes humaines

Myotonic Dystrophy type 1

CRISPR/Cas9

Human pluripotent stem cells

Résumé

L'épissage alternatif est apparu comme un mécanisme fondamental non seulement pour la diversification des isoformes des protéines mais aussi pour la régulation spatio-temporelle du développement. Par conséquent, une meilleure compréhension de la manière dont ce mécanisme est régulé permettrait non seulement d'élucider les principes biologiques fondamentaux, mais aussi de déchiffrer les mécanismes pathologiques impliqués dans les maladies dans lesquelles ces processus moléculaires sont dérégulés. Dans le cadre de cette thèse, nous avons utilisé des cellules souches pluripotentes humaines pour déchiffrer, au cours de la myogenèse humaine, le rôle des protéines MBNL, une famille de régulateurs d'épissage spécifiques aux tissus dont la perte de fonction est associée à la dystrophie myotonique de type 1 (DM1), une maladie neuromusculaire héréditaire. Grâce à la technologie CRISPR/Cas9, nous avons généré des cellules souches pluripotentes d'origine humaine (hiPSC) déplétées en protéines MBNL et évalué les conséquences moléculaires et fonctionnelles de cette perte sur la génération de cellules musculaires squelettiques. Nos résultats ont indiqué que les protéines MBNL sont spécifiquement requises pour la maturation myogénique tardive mais pas pour l'engagement myogénique précoce. Par une analyse transcriptomique, nous avons pu mettre en évidence les voies moléculaires régulées par ces protéines durant la myogenèse, ainsi que les phénomènes de compensation entre les paralogues MBNL. Cette étude nous a également permis d’identifier un nouveau défaut d’épissage alternatif dans la DM1, régulé par les protéines MBNL, et qui aboutit à des anomalies structurelles du compartiment post-synaptique musculaire. Ensemble, nos résultats révèlent à la fois la temporalité de l’action des protéines MBNL dans la myogenèse humaine et permettent également d’identifier de nouvelles voies moléculaires régulées par ces protéines et pouvant être impliquées dans le développement de la DM1. A plus long terme, les outils développés dans cette étude devraient également faciliter l'identification de nouvelles stratégies thérapeutiques capables de faire face à la perte de fonction de ces protéines.

Alternative splicing has emerged as a fundamental mechanism not only for the diversification of protein isoforms but also for the spatiotemporal control of development. Therefore, a better understanding of how this mechanism is regulated has the potential not only to elucidate fundamental biological principles, but also to decipher pathological mechanisms involved in diseases where normal splicing networks are mis-regulated. As part of this thesis, we took advantage of human pluripotent stem cells to decipher during human myogenesis the role of MBNL proteins, a family of tissue-specific splicing regulators whose loss of function is associated with Myotonic Dystrophy type 1 (DM1), an inherited neuromuscular disease. Thanks to the CRISPR/Cas9 technology, we generated human-induced pluripotent stem cells (hiPSCs) depleted in MBNL proteins and evaluated the molecular and functional consequences of this loss on the generation of skeletal muscle cells. Our results indicated that MBNL proteins are specifically required for the late myogenic maturation but not for early myogenic commitment. By a transcriptomic analysis, we were able to highlight the molecular pathways regulated by these proteins during myogenesis, as well as the compensatory effects between MBNL paralogs. This study also allowed us to identify a new alternative splicing defect in DM1, regulated by MBNL proteins, which leads to structural abnormalities of the muscular post-synaptic compartment. Together, our results reveal the temporal requirement of MBNL proteins in human myogenesis and allow the identification of new molecular pathways regulated by these proteins that could be involved in the development of DM1. In the longer term, the tools developed in this study should also facilitate the identification of new therapeutic strategies capable to cope with the loss of function of these proteins.