Caractérisation de la voie de signalisation dépendante des canaux calciques Cav1.2 et Cav1.3 dans les lymphocytes Th2 : impact sur l'asthme allergique

deciphering the signaling pathway dependent on cav1.2 and cav1.3 calcium channels in th2 lymphocytes : impact on allergic asthma

• Auteur / Autrice : Chi-Minh Giang
• Direction : Magali Savignac, Lucette Pelletier
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Immunologie
• Date : Soutenance le 24/03/2021
• Etablissement(s) : Toulouse 3
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie Santé Biotechnologies (Toulouse)
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Roland Liblau
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Dieudonnée Togbe, Thierry Capiod, Romain Roncagalli

Mots clés

Mots clés contrôlés

Asthme

Cellules T auxiliaires

Canaux calciques

Mots clés libres

Canaux calciques

Lymphocytes T auxiliaires de type 2

Signalisation

Asthme allergique

PKC alpha

Résumé

Les lymphocytes T auxiliaires (LTh) orchestrent les réponses immunitaires adaptatives et sont composés de différentes sous-populations avec des fonctions effectrices spécifiques. Les LTh de type 2 produisant les interleukines (IL)-4, -5 et -13 permettent l’éradication de parasites mais peuvent causer l’asthme allergique. Mon équipe d’accueil a précédemment décrit que contrairement aux autres LT, les LTh2 murins et humains expriment les canaux calciques voltage-dépendants Cav1.2 et Cav1.3 qui sont essentiels pour leurs fonctions. Afin d’étudier le rôle respectif de chacun de ces canaux, nous avons développé des souris déficientes pour Cav1.2 dans les LT et pour Cav1.3. J’ai montré́ que la perte d’un seul des deux canaux suffit pour affecter la fonction des LTh2 en les rendant partiellement réfractaires à la stimulation par le TCR, avec une altération des évènements proximaux de signalisation du TCR ainsi que des réponses calciques et cytokiniques diminuées. Les influx calciques membranaires au repos ou très précocement après engagement du TCR mesurés par microscopie TIRF soulignent des rôles distincts des deux canaux : les deux sont nécessaires pour l’entrée calcique après stimulation, mais Cav1.3 est également important pour l’homéostasie calcique. La perte d’un canal ou de l’autre prévient le développement d’asthme allergique dans des modèles murins. Cette diminution de pathogénicité est due à la perte intrinsèque de l’expression de l’un ou l’autre des canaux sur les LTh2. De plus, j’ai démontré que les deux canaux doivent être présents sur le même LT pour induire l’asthme allergique : ils ont des fonctions non redondantes et synergiques. Ces données sont en accord avec mes résultats sur les LT du sang d’enfants asthmatiques dans lesquels l’expression des cytokines Th2 est préférentiellement détectée dans les échantillons exprimant les deux canaux. Afin d’identifier les mécanismes d’activation des canaux Cav1 dans les LTh2 qui sont des cellules non excitables, j’ai montré que la seule activation des PKC permettait une réponse calcique et la production de cytokines de façon dépendante des Cav1. De plus, la PKC interagit physiquement avec le canal Cav1.3 après activation des LTh2 (contrairement à Cav1.2) et son inhibition pharmacologique ou grâce à des oligonucléotides antisens empêche le développement d’asthme allergique dans des modèles murins. Enfin, pour identifier de façon globale et non biaisée les conséquences de la délétion d’un canal ou de l’autre sur l’activation des LTh2, nous avons effectué des expériences de phosphoprotéomique et de RNA sequencing. Ces approches ont permis de mettre en avant le rôle des canaux dans la phosphorylation des voies très précoces du TCR (protéines adaptatrices, de la signalisation calcique et du cytosquelette d’actine) qui est associé à plus long terme sur une altération des voies transcriptionnelles du transport ionique, de la signalisation, de la réponse aux stimuli et de la communication cellulaire. L’ensemble de mes travaux permet de caractériser la voie de signalisation dépendante des canaux Cav1.2 et Cav1.3 dans les LTh2 après activation du TCR. Cela pourrait permettre d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement d’allergies tout en préservant les autres sous-populations de LT utiles pour les réponses anti-infectieuses par exemple.

CD4+ T helper lymphocytes (TL) orchestrate the adaptative immune responses and are composed of distinct subpopulations with specific effector functions. Type-2 T helper (Th2) cells that produce interleukin (IL)-4, -5 and -13 allow large parasite clearance but may cause allergic asthma. My host team has previously described that mouse and human Th2 cells (but not other TL) selectively express Cav1.2 and Cav1.3 voltage-gated calcium channels that are crucial for their functions. In order to study the respective role of each of these channels, we developed mice deficient for Cav1.2 in TL or for Cav1.3. I showed that the loss of only one of the two channels was sufficient to dampen Th2 functions, making them partially refractory to TCR stimulation, with an alteration of the proximal TCR signalling events, and lowered calcium and cytokine responses. The membrane calcium influxes at steady state or very early after TCR engagement measured by TIRF microscopy show distinct roles for the two channels: both are necessary to calcium entry after stimulation, but Cav1.3 is also important for calcium homeostasis. The absence of one channel or the other prevents the development of allergic asthma in mouse models. This diminution of pathogenicity is due to the intrinsic absence of one or the other channel on Th2 cells. Moreover, I have demonstrated that both channels must be expressed on the same TL to induce allergic asthma: they have non-redundant and synergistic functions. These data are in agreement with my results on TL from the blood of asthmatic patients in which Th2-cytokine expression is preferentially detected in samples expressing both channels. In order to decipher the activation mechanisms of Cav1 channels in Th2 lymphocytes that are non-excitable cells, I have shown that the activation of PKCs alone is sufficient for calcium response and Th2-cytokine production in a Cav1-dependent manner. Besides, PKC physically interacts with Cav1.3 channel after Th2 stimulation (contrary to Cav1.2) and its inhibition using pharmacological compound or antisense oligodeoxynucleotides impairs the development of mouse models of allergic asthma. Finally, to identify in a global and unbiased manner the consequences of the loss of one channel or the other in Th2 cells, we have performed phosphoproteomic and RNA sequencing experiments. They pinpoint the role of Cav1 channels on early TCR-driven phosphorylation events (adaptor proteins, calcium signalling and actin cytoskeleton rearrangement) that are associated with transcriptional impact on pathways referred to ion transport, signalling, response to stimuli and cell communication. To conclude, my work deciphers Cav1.2- and Cav1.3-dependant signalling pathways in Th2 cells after TCR stimulation. This may identify new therapeutic targets for the treatment of allergy, while preserving other populations of LT useful for the anti-infectious responses for example.