Caractérisation des mécanismes d’ADP-ribosylation de l'ADN et son rôle dans la signalisation des dommages à l'ADN

Characterization of DNA ADP-Ribosylation Mechanism and its Role in DNA Damage Signaling

• Auteur / Autrice : Elie Matta
• Direction : Alexander Ishchenko
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Soutenance le 06/03/2020
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Cancérologie : biologie-médecine-santé (Villejuif, Val-de-Marne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Intégrité du génome et cancers (Villejuif, Val-de-Marne ; 2010-....)
• Partenaire(s) de recherche : référent : Université Paris-Saclay. Faculté de médecine (Le Kremlin-Bicêtre, Val-de-Marne ; 2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Svetlana Dokudovskaya
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Sébastien Huet, Didier Gasparutto, Jean-Baptiste Charbonnier, Mounira Amor-Guéret
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Sébastien Huet, Didier Gasparutto

Mots clés

Mots clés contrôlés

Dissertation universitaire

Réparation de l'ADN

Mécanisme d'action (biochimie)

Protéomique

Poly (ADP-ribose) polymérase

Mots clés libres

PARPs

ADP-Ribosylation de l'ADN

Spécificité du substrat PARP

Nhej

Réparation des cassures double brins.

PARPs

DNA ADP-Ribosylation

PARP substrate specificity

Nhej

DSB repair

Résumé

Les poly (ADP-ribose) polymérases dépendantes de l’ADN (PARPs) PARP1, PARP2 et PARP3 agissent comme des détecteurs de cassures d'ADN signalant des dommages à l'ADN. Lors de la détection des dommages à l'ADN, ces PARPs utilisent le nicotinamide adénine dinucléotide comme substrat pour synthétiser un monomère ou un polymère d'ADP-ribose (MAR ou PAR, respectivement) attaché de manière covalente au résidu accepteur des protéines cibles. Récemment, il a été démontré que les protéines PARP1–3 peuvent directement ADP-ribosyler les cassures d'ADN en attachant les oligomères MAR et PAR aux phosphates terminaux.Néanmoins, peu de choses sont connues sur les mécanismes régissant la reconnaissance et la spécificité du substrat de PARP1, qui représente la majeure partie de l'activité de PARylation cellulaire, ainsi que sur les protéines responsables de la détection et de l'élimination des adduits d'ADN ADP-ribosylés et son rôle dans une multitude de processus cellulaires. Dans cette étude, nous avons caractérisé de manière détaillée la spécificité du substrat (ADN) de PARP1 et des mécanismes de la PARylation de l'ADN. Nous avons montré que le résidu phosphate 3'-terminal aux extrémités des cassures de l'ADN double brin servait de site accepteur majeur pour la PARylation catalysée par PARP1 en fonction de l'orientation et de la distance entre les cassures du brin d'ADN dans une seule molécule d'ADN. De plus, une préférence pour l’ADP-ribosylation des molécules d'ADN contenant du phosphate 3'-terminal a été observée par rapport à l'auto-ADP-ribosylation de PARP1, et un modèle de modification de l'ADN par PARP1 a été proposé. Des résultats similaires ont été observés avec l’enzyme PARP1 recombinante purifiée et des extraits provenant des cellules HeLa. Ainsi, les effets biologiques de l’ADP-ribosylation médiée par PARP peuvent dépendre fortement de la configuration des cassures complexes des brins d'ADN. De plus, nous avons élaboré une nouvelle approche permettant d’identifier et valider les protéines responsables de la détection («readers») ou de l'élimination («erasers») des adduits ADN- ADP-ribose. Nos données protéomiques ont révélé que les adduits de l'ADN MARylé modulaient sélectivement la reconnaissance de l'ADN par un grand nombre de protéines impliquées dans différentes voies de signalisation cellulaire. Environ 90 protéines, y compris des complexes protéiques, ont été sélectionnées comme lecteurs («readers») potentiels d'adduits ADN-MARylé. Le rôle de l'ADP-ribosylation de l’ADN dans la jonction d'extrémités non homologues (NHEJ) a été partiellement caractérisé dans une étude in vitro. Nous avons démontré que l'ADP-ribosylation de l’extrémité de la cassure double brin («DSB») peut conduire à l'inhibition de la réparation de la DSB bout franc par la voie NHEJ canonique si elle n'est pas éliminée par la glycohydrolase PARG. Au contraire, la présence d'une coupure («nick») proximale avec un site apurinique / apyrimidinique stabilisé conduit à une efficacité NHEJ accrue, apparemment de manière indépendante de l'ADP-ribosylation. Enfin, nous avons recherché de nouveaux inhibiteurs de PARP1, PARP2 et PARP3 parmi les dérivés de 1,4-dihydropyridine, ayant une capacité de liaison à l'ADN. Nos résultats ont révélé que certains analogues de NAD + pourraient être utilisés par les PARPs pour la modification de l'ADN conduisant à la stabilisation des adduits MARylés et PARylés correspondants, en raison de leur résistance à l'activité d'hydrolyse des PARG. Ensemble, ces données mettent en évidence la pertinence physiologique et les résultats biologiques possibles de l’ADP-ribosylation de l’ADN catalysée par les protéines PARPs, tels que la fourniture d'une référence stable de l'emplacement d'une cassure du brin d'ADN sur une carte de chromatine, le recrutement de protéines de réparation de l'ADN et l'inhibition du mécanisme NHEJ toxique.

DNA-dependent poly(ADP-ribose) polymerases (PARPs) PARP1, PARP2 and PARP3 act as DNA break sensors signaling DNA damage. Upon detecting DNA damage, these PARPs use nicotine adenine dinucleotide as a substrate to synthesize a monomer or polymer of ADP-ribose (MAR or PAR, respectively) covalently attached to the acceptor residue of target proteins. Recently, it was demonstrated that PARP1–3 proteins can directly ADP-ribosylate DNA breaks by attaching MAR and PAR moieties to terminal phosphates. Nevertheless, little is still known about the mechanisms governing substrate recognition and specificity of PARP1, which accounts for most of cellular PARylation activity, as well, about proteins responsible for detection and removal of ADP-ribosylated DNA adducts and its role in multitude of cellular processes.In this study we provide a detailed characterization of PARP1 DNA substrate specificity and mechanisms of DNA PARylation. We showed that the 3′-terminal phosphate residue at double-strand DNA break ends served as a major acceptor site for PARP1-catalysed PARylation depending on the orientation and distance between DNA strand breaks in a single DNA molecule. Moreover, a preference for ADP-ribosylation of DNA molecules containing 3′-terminal phosphate over PARP1 auto-ADP-ribosylation was observed, and a model of DNA modification by PARP1 was proposed. Similar results were obtained with purified recombinant PARP1 and HeLa cell-free extracts. Thus, the biological effects of PARP-mediated ADP-ribosylation may strongly depend on the configuration of complex DNA strand breaks. Furthermore, we elaborated a new research technique to identify and validate proteins responsible for ADP-ribose-DNA adducts detection (“readers”) or removal (“erasers”). Our proteomic data revealed that MARylated DNA adducts selectively modulated DNA recognition of a large number of proteins involved in different cellular pathways. About 90 proteins including protein complexes were selected as potential MAR-DNA adduct readers. The role of DNA ADP-ribosylation in non-homologous end-joining (NHEJ) was partially characterized in an in vitro study. We demonstrated that ADP-ribosylation of DSB terminus can lead to inhibition of blunt DSB repair by canonical NHEJ if not removed by PARG glycohydrolase. Contrary, presence of a proximal nick with a stabilized apurinic/apyrimidinic site leads to increased NHEJ efficiency, apparently in ADP-ribosylation-independent manner. Finally we searched for novel PARP1, PARP2 and PARP3 inhibitors among derivatives of 1,4-dihydropyridine with DNA binding capacity. Our results revealed that some of NAD+ analogues analogs could be used by PARPs for DNA modification leading to stabilization of corresponding MARylated and PARylated adducts due to their PARG hydrolysis activity resistance. Taking together, these data highlight the physiological relevance and possible biological outcomes of PARP-catalyzed DNA-ADP-ribosylation such as providing a stable benchmark of the location of a DNA strand break on a chromatin map, recruitement of DNA repair proteins and inhibition of the toxic NHEJ.