Régulation du transport axonal par l'activité neuronale : Implication pour le développement des réseaux neuronaux

by Eve Moutaux

Doctoral thesis in Neurosciences neurobiologie

Under the supervision of Frédéric Saudou.

defended on 10-06-2020

in Université Grenoble Alpes , under the authority of École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble) , in a partnership with Institut des neurosciences de Grenoble (laboratoire) .

Thesis committee President: Annie Andrieux.

Thesis committee members: Frédéric Saudou, Christophe Leterrier.

Examiners: Zsolt Lenkei, Xavier Nicol.

keywords

• Axonal transport
• Microfluidic chamber
• Microelectrode array
• Axon
• Neuronal network
• Axonal branches

Alternative Title

Axonal transport regulation : Implication for the development of neuronal network

Abstract

During postnatal development, long-distance axonal projections form branches to connect with their targets. Establishment and remodeling of these projections are tightly regulated by neuronal activity and require a large amount of secretory material and trophic factors, such as brain derived neurotrophic factor (BDNF). Axonal transport is responsible for addressing trophic factors packed into vesicles to high demand sites where mechanisms of secretion are well-known. However, mechanisms controlling the preferential targeting of axonal vesicles to active sites in response to neuronal activity are unknown.In this work, we first developed tools to study intracellular dynamics in neuronal networks. We thus developed a microfluidic chamber to reconstruct physiologically-relevant networks in vitro which is compatible with high resolution videomicroscopy. We characterized the formation and maturation of reconstructed networks and we validated the relevance of the microfluidic platform in the context of Huntington’s disease. We then studied the evolution of intracellular dynamics with the maturation of reconstructed neuronal networks in microfluidic chambers. We observed an increase of anterograde axonal transport of secretory vesicles during maturation. These first results lead us to think that neuronal activity could regulate axonal transport of secretory vesicles over maturation of the network.Therefore, we improved the in vitro microfluidic system with a designed microelectrode array (MEA) substrate allowing us to record intracellular dynamics while controlling neuronal activity. Using this system, we identified an axon-resident reserve pool of secretory vesicles recruited upon neuronal activity to rapidly distribute secretory materials to presynaptic sites. We identified the activity-dependent mechanism of recruitment of this axonal pool of vesicles along the axon shaft. We showed that Myosin Va ensures the tethering of vesicles in the axon shaft in axonal actin structures. Specifically, neuronal activity induces a calcium increase after activation of Voltage Gated Calcium Channels along the axon, which regulates Myosin Va and triggers the recruitment of tethered vesicles on microtubules. We then showed the involvement of this activity-dependent pool for axon branches formation during axon development. By developing 2-photon live microscopy of axonal transport in acute slices, we finally confirmed that a pool of axon-resident static vesicles is recruited by neuronal activity in vivo with a similar kinetic.Altogether, this work provides new in vitro and in vivo tools to study intracellular dynamics in physiological networks. Using these tools, we identified the existence of a local mechanism of axonal transport regulation along the axon shaft, allowing rapid supply of trophic factors to developing branches.

keywords

• Transport axonal
• Chambre microfluidique
• Microélectrode
• Axone
• Réseaux neuronaux
• Branches axonales
• Transport antérograde
• Microélectrodes
• Flux axonal
• Réseaux neuronaux (physiologie)

Abstract

Pendant le développement, les projections axonales à longue distance se ramifient pour se connecter à leurs cibles. L’établissement et le remodelage de ces connexions est notamment régulé par l’activité neuronale. L’adaptation de la morphologie de l’axone nécessite alors des quantités importantes de matériel sécrétoire et de facteur trophiques comme le BDNF (brain derived neurotrophic factor). Ce matériel est transporté dans des vésicules le long de l’axone depuis le corps cellulaire où il est synthétisé, vers les sites actifs à l’extrémité de l’axone. Si le relargage de vésicules sécrétoires à la synapse est bien étudié, les mécanismes régulant le transport axonal par l’activité sont encore méconnus.Dans ce travail de thèse, nous avons dans un premier temps développé des outils permettant d’étudier les dynamiques intracellulaires dans des réseaux neuronaux. Nous avons ainsi développé une chambre microfluidique permettant de reconstruire in vitro des réseaux neuronaux physiologiques et compatibles avec de la vidéomicroscopie à haute résolution. Nous avons caractérisé l’établissement et la maturation du réseau et validé l’intérêt de ce dispositif microfluidique dans le contexte de la maladie de Huntington. Nous avons ensuite étudié l’évolution des dynamiques intracellulaires avec la maturation du réseau. Nous avons notamment observé une augmentation du transport axonal de vésicules sécrétoires en fonction de l'état de maturation du réseau neuronal. Ces premières observations ont renforcé l’hypothèse d’une régulation directe du transport axonal de vésicules sécrétoires par l’activité neuronale au cours du développement du réseau.Nous avons ainsi fait évoluer la plateforme microfluidique par l’ajout d’un réseau d’électrodes (MEA) qui permet d'étudier les dynamiques intracellulaires tout en contrôlant l’activité neuronale. A l’aide de ce système, nous avons identifié un groupe de vésicules sécrétoires ancré le long de l’axone et recruté en réponse à une haute activité neuronale en direction des sites présynaptiques actifs. Nous avons alors identifié les acteurs impliqués dans ce mécanisme dépendant de l’activité. Nous avons montré que la myosine Va permettait l’attachement des vésicules le long de l’axone dans des structures d’actine dynamique. L’activité neuronale induit une augmentation de calcium le long de l’axone, via l’activation des canaux calciques dépendant du voltage, qui régule la myosine Va et entraine le recrutement des vésicules stockées dans l’axone sur les microtubules. Une fois les acteurs identifiés, nous avons pu mettre en évidence le rôle de ce mécanisme dépendant de l’activité dans la formation de branches axonales pendant le développement. Enfin, nous avons confirmé l’existence de ce groupe de vésicules dépendant de l’activité et résidant dans l’axone in vivo grâce à la mise au point d'un système d’étude du transport axonal sur tranches aigües de cerveau en microscopie biphotonique.L’ensemble de ce travail propose de nouveaux outils in vitro et in vivo pour comprendre les régulations des dynamiques intracellulaires dans des réseaux neuronaux physiologiques. Grâce à ces outils, nous avons identifié un mécanisme de régulation local qui permet l'adressage rapide de facteurs trophiques vers les branches en développement en réponse à l’activité neuronale.