Développement d'une nouvelle méthode de biopsie liquide pour la détection des biomarqueurs de cancer

The development of a new isothermal amplification method for the digital detection of miRNA biomarkers

• Auteur / Autrice : Roberta Lima de Castro Menezes
• Direction : Valérie Taly
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Interdisciplinaire
• Date : Soutenance le 07/06/2019
• Etablissement(s) : Sorbonne Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Frontières de l'innovation en recherche et éducation (Paris ; 2006-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement de préparation : Université Paris Descartes (1970-2019)
• Jury : Président / Présidente : Anne-Marie Gué
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Anne-Marie Gué, Laurent Malaquin, Séverine Le Gac
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Laurent Malaquin, Séverine Le Gac

Mots clés

Mots clés contrôlés

méthodes

Biopsie liquide

MicroARN

Cancer -- Prévention

Mots clés libres

Biomarqueurs

Microlfuidique

MicroARN

Cancer

Detection

Biopsie liquide

Biomarkers

Microfluidics

MicroRNA

Cancer

Detection

Liquid biopsy

Résumé

Les microARN apparaissent depuis plusieurs années comme une des biomarqueurs prometteurs pour le diagnostic et suivi de cancers, notamment du fait de leur accessibilité à partir de biopsies liquides (sang, urine) minimalement invasives pour les patients. Toutefois, leur détection reste difficile de part leur petite taille, leur faible concentration et leur forte dilution dans ces échantillons. Ainsi, ce projet de recherche vise à concevoir une méthode de détection sensible, spécifique et quantitative dédiée à la mesure des microARN dans divers milieux biologiques. La programmation moléculaire est une discipline émergente reposant sur le design de réseaux de réactions biomoléculaires adoptant un comportement spécifique (e.g. oscillations, multistabilité, auto-assemblage,...). Inspirée d'une approche modulaire, nous avons conçu un programme moléculaire capable de convertir la présence d'un microARN en signal fluorescent avec une très grande spécificité. Le programme moléculaire est sous la forme d'un circuit d'acides nucléiques servant de support à des réactions enzymatiques in vitro catalysant la synthèse et dégradation de brin d'ADN. Nous avons adapté cette nouvelle chimie d'amplification à un format digital en gouttes qui permet la détection de molécules uniques distribuées dans des gouttes et ainsi une mesure hypersensible (femtoM au picoM) et quantitative des cibles microARN. Les travaux de cette thèse se concentrent sur la validation de cette technologie sur tissus humains tumorales et sains.

An emerging method for detecting cancer, involves the profiling of circulating microRNAs (miRNAs), potentially amenable as an early-stage, minimally invasive diagnosis. The expression levels of miRNAs have been correlated with the development of many diseases, including cancer. However, their detection can be challenging, because they have very short sequences, very high sequence homology and are present in low concentrations in human samples (e.g. blood, urine, etc.). Therefore, the tools used to profile miRNAs need to be sensitive, specific and quantitative. The goal of this thesis was to develop a new liquid biopsy method, utilizing molecular programming to profile miRNAs in human samples. Molecular programming is an emerging discipline that aims at designing artificial nucleic acid networks exhibiting specific functions. Using a modular approach, we developed a DNA-based molecular program that is a dynamic system converting the presence of a microRNA target molecule into a fluorescent signal, with a high specificity. This detection system was combined with droplet-based microfluidics to provide absolute quantification of the target, via digital counting of droplets. This method successfully displays high sensitivity, with a limit of detection in the picomolar to femtomolar range. This thesis focused on the optimization and validation of this method for endogenous miRNA detection in human samples.