Sélection d'inhibiteurs contre la machinerie de coiffage des ARN messagers et étude structurale du macro domaine chez les alphavirus

Inhibitors of the mRNA capping machinery and structural studies on macro domains from alphaviruses

• Auteur / Autrice : Ana Sofia Ferreira Ramos
• Direction : Bruno Coutard, Gerlind Sulzenbacher
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie structurale
• Date : Soutenance le 08/07/2019
• Etablissement(s) : Aix-Marseille
• Ecole(s) doctorale(s) : Ecole Doctorale Sciences de la Vie et de la Santé (Marseille)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Architecture et Fonction des Macromolécules Biologiques (AFMB) (Marseille)
• Jury : Président / Présidente : Bruno Canard
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Hélène Malet
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Laurence Briant, Martijn Van Hemert

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cristallographie

ADP-ribosylation

ARN messagers

Antiviraux

Alphavirus

Mots clés libres

Alphavirus

Antiviraux

Complexe de réplication

Coiffe d'ARNm

NsP1

Criblage à haut débit

NsP3

Macro domaine

Ribosylation

ADP-Ribose

Cristallographie

Granules de stress

G3bp

Alphaviruses

Antivirals

Replication complex

MRNA capping

NsP1

Guanylylation

Approved drugs

HT screening

NsP3

Macro domains

Ribosylation

ADP-Ribose

DeMARylation

Crystallography

Stress-Granules

G3bp

Résumé

Les alphavirus comme le virus Chikungunya et le virus de l'encéphalite équine vénézuélienne sont des arbovirus (ré)-émergents. Ils possèdent un mécanisme de coiffe de l’ARNm non conventionnel catalysé par nsP1 et nsP2 pour former une structure cap-0 (m7GpppN-) qui est cruciale pour la réplication. Le coiffage constitue une cible antivirale attractive. NsP1 catalyse trois activités: méthyltransférase, guanylylation de nsP1 (GT), et transfert sur l’ARNm. Nous avons développé un test pour cribler la chimiothèque de composés de Prestwick Chemical® contre l’activité GT de nsP1. 18 composés sont ressortis de ce crible et trois séries de composés ont été sélectionnées pour une caractérisation plus poussée. Ces composés inhibent peu une MTase cellulaire suggérant leur spécificité vis-à-vis de nsP1. Des analyses de relations structure/activité (SAR) ont également été initiées pour identifier les pharmacophores actifs. Ce travail montre que notre test permet de sélectionner des composés spécifiques ciblant le coiffage de l’ARNm des alphavirus. NsP3 consiste en un Macro domaine, un domaine de liaison au zinc et une région hypervariable. Le Macro domaine est essentiel à la réplication virale en fixant l’ADP-ribose (ADPr) et en dé-ribosylatant des protéines cellulaires. Nous avons effectué une étude structurale et fonctionnelle du Macro domaine du virus Getah (GETV) dont la séquence de la boucle catalytique présente des particularités. Cette étude a permis de caractériser plusieurs poses adoptées par l’ADPr dans le site actif. Ces poses peuvent représenter plusieurs instantanés du mécanisme de l’ADP-ribosylhydrolase, et mettent en lumière de nouveaux résidus à caractériser.

Alphaviruses such as Chikungunya virus and Venezuelan equine encephalitis virus (VEEV) are (re-)emerging arboviruses. They own an unconventional mRNA capping catalysed by nsP1 and nsP2 leading to the formation of a cap-0 structure (m7GpppN-), which is crucial for virus replication and constitutes an attractive antiviral target. NsP1 catalyses three activities: methyltransferase (MTase), guanylylation (GT) and guanylyltransferase (GTase). A high throughput ELISA was developed to monitor the GT reaction and screen the Prestwick Chemical library®. The IC50 was determined for 18 selected hit compounds. Three series of compounds were selected for further characterization. These compounds poorly inhibit a cellular MTase suggesting their specificity against nsP1. Analogue search and structural activity relationships (SAR) were also initiated to identify the active pharmacophore features. The results show that our strategy is a convenient way to select specific hit compounds targeting the mRNA capping of alphaviruses. NsP3 consists in a Macro domain at the N-terminal, a zinc binding domain and a C-terminal hypervariable region. The Macro domain is essential for the replication through ADP-ribose (ADPr) binding and de-ribosylation of cellular proteins. In order to better understand this mechanism, we initiated a structure-based study of Getah virus (GETV) Macro domain, which contains a peculiar substitution in the catalytic loop. By crystallographic studies we characterized several poses adopted by ADPr in the binding site. Together, these poses may represent several snapshots of the ADP-ribosylhydrolase mechanism, highlighting new residues to be further characterised.