Mise au point d'une méthode de mesure d'interaction ligand-ARN par électrochimie

Development of an electrochemical method for the detection of RNA/ligands interactions

• Auteur / Autrice : Hélène Guyon
• Direction : Laurent Micouin, Benoît Limoges
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie
• Date : Soutenance le 24/10/2016
• Etablissement(s) : Sorbonne Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Médicament, toxicologie, chimie, imageries (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement de préparation : Université Paris Descartes (1970-2019)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de Chimie et de Biochimie Pharmacologiques et Toxicologiques / LCBPT - UMR 8601
• Jury : Président / Présidente : Claudine Buess-Herman
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Laurent Micouin, Benoît Limoges, Claudine Buess-Herman, Éric Ennifar, Corinne Ravelet, Carine Tisné
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Éric Ennifar, Corinne Ravelet

Mots clés

Mots clés contrôlés

Reconnaissance moléculaire

Aminosides

Criblage pharmacologique

Électrochimie

Interactions ARN-ligand

Mots clés libres

Aminoglycosides

ARN

Ligands

Reconnaissance moleculaire

Électrochimie

Criblage

Aminoglycosides

RNA

Ligands

Molecular interaction

Electrochemistry

Screening

Résumé

Etant donné leur implication dans de nombreux processus biochimiques, les ARN sont maintenant considérés comme des cibles thérapeutiques très prometteuses. Cependant, nos connaissances limitées concernant les phénomènes d'interaction entre les ARN et de petites molécules, compliquent l'élaboration de nouveaux ligands (ou médicaments), capables de reconnaître sélectivement une structure complexe d'ARN. En absence de toute approche rationnelle, une stratégie de criblage pourrait permettre de mieux comprendre ces phénomènes de reconnaissance. Cette thèse porte sur la mise au point d'une méthode électrochimique, simple, adaptée pour du criblage haut-débit et permettant de détecter et de quantifier les interactions ARN/ligands. Le principe de la méthode repose sur la différence de coefficient de diffusion qui existe entre la forme libre d'un ligand possédant des propriétés redox et sa forme complexée à l'ARN. Cette stratégie de détection par voie électrochimique présente comme avantages d'être peu coûteuse, rapide, simple d'utilisation, adaptée pour du criblage haut-débit de molécules et utilisable dans de faibles volumes. Cette méthodologie a été utilisée pour caractériser la formation d'un complexe entre un analogue d'aminoglycoside porteur d'un groupe ferocene et une séquence d'ARNr 16S23. De plus, des expériences de compétition entre le complexe ARN/ligand redox et des aminoglycosides non modifiées permettent d'étendre la méthode à la détermination de constantes de dissociation (KD) pour des molécules non marquées en phase homogène. Ces expériences de compétition pourront être généralisées pour mesurer le KD de librairies de molécules, permettant ainsi de trouver de meilleurs ligands d'ARN.

RNA molecules play a major role in various biochemical processes and they are now considered as an important drug target. However, our limited understanding of the interactions occurring between small molecules and RNA complicate the search for new ligands (or drugs) with improved specific interaction and binding to elaborated RNA structures. In the absence of any rational approach, a screening strategy could shed light on the ligand/RNA interactions. In this thesis, we describe a simple electrochemical approach allowing for high-throughput detection and quantification of small molecule/RNA interactions. The principle of the method relies on the difference of diffusion rates between a redoxmolecular probe free or bound to its RNA target and thus to the ability to more easily electrochemically detect the forme rover the latter in a homogenous solution. This electrochemical detection strategy has the advantages of being affordable,fast, easy to use, sensitive and well-adapted to a high-throughput screening strategy in small volume samples. This methodology was used to characterize the binding of an aminoglycoside analog bearing a ferocenyl group to the ribosomal RNA fragment (rRNA 16S23). Furthermore, competitive binding of unlabelled aminoglycosides on theRNA/electrochemical probe complex allowed us to evaluate their dissociation constants (KD). These competitive experiments could further be generalized to measure KD values for libraries of molecules, which could help to find better RNA ligands.