Rôle de l'activité méthyltransférase de la protéine PRDM9 dans la recombinaison méiotique chez la souris

Role of PRDM9 methyltransferase activity in mouse meiotic recombination

• Auteur / Autrice : Boubou Diagouraga
• Direction : Bernard de Massy, Frédéric Baudat
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Soutenance le 15/12/2015
• Etablissement(s) : Montpellier
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé (Montpellier ; Ecole Doctorale ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de génétique humaine (Montpellier)
• Jury : Président / Présidente : Déborah Bourc'his
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Bernard de Massy, Frédéric Baudat, Déborah Bourc'his, Sophie Rousseaux, Mireille Bétermier, Scott Keeney
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Sophie Rousseaux, Mireille Bétermier

Mots clés

Mots clés contrôlés

Méiose

Méthylation

Chromatine

Recombinaison génétique

Méiose

Mots clés libres

Prdm9

Méiose

Recombinaison

Chromatine

Méthylation

Prdm9

Meiosis

Recombination

Chromatin

Methylation

Résumé

Chez les organismes à reproduction sexuée, les gamètes (cellules sexuelles) sont produits par un processus comprenant deux divisions successives appelé méiose. Durant la première division, la recombinaison méiotique permet un contact physique et un échange de matériel génétique entre les chromosomes homologues. Elle résulte de la réparation, par recombinaison homologue, de cassures double-brin de l’ADN générées par la protéine SPO11 au début de la prophase de la première division. Chez les mammifères, les évènements de recombinaison se situent dans des régions de 1-2 kb appelées points chauds de recombinaison. La protéine PRDM9, qui contient un domaine PR/SET et des doigts de zinc, détermine la position des points chauds en ciblant des séquences spécifiques d’ADN par ses doigts de zinc. Son domaine PR/SET porte une activité lysine méthyltransférase, corrélée avec un enrichissement de H3K4me3 au niveau des points chauds, dans les spermatocytes.Les objectifs de mon travail étaient de caractériser l’activité catalytique de PRDM9 et d’étudier son rôle dans l’initiation de la recombinaison chez la souris. La structure cristallisée du domaine PR/SET de PRDM9 en complexe avec un peptide de l’histone H3 nous a permis de montrer que ce domaine adopte une structure similaire aux domaines SET canoniques portés par d’autres méthyltransférases, et d’identifier des résidus clés pour son activité. Nous montrons que le domaine PR/SET de PRDM9 méthyle in vitro non seulement H3K4, mais aussi H3K9 et H3K36. Nous confirmons in vivo la triméthylation de H3K36 dépendante de PRDM9 dans les spermatocytes. Utilisant deux allèles différents de PRDM9, Prdm9b et Prdm9wm7, qui activent des points chauds différents grâce à leur spécificité de séquence, nous avons généré des lignées de souris exprimant des allèles mutés du domaine PR/SET dont l’activité catalytique est abolie, Prdm9wm7G278A ou Prdm9wm7Y357F. La protéine mutante PRDM9wm7Y357F se fixe à ses cibles, mais n’y permet in vivo ni la triméthylation de H3K4, ni celle de H3K36. Enfin, nous montrons que l’activité catalytique de PRDM9 est requise pour promouvoir la recombinaison aux points chauds. Chez les souris exprimant uniquement un allèle Prdm9 muté, les spermatocytes présentent des défauts d’appariement des chromosomes homologues et de réparation des cassures double-brin de l’ADN, ainsi qu’un arrêt de la progression en méiose en milieu de prophase I, phénotype similaire à celui de la souris KO pour Prdm9 (Prdm9-/-). L’ensemble de nos résultats met en évidence le rôle primordial de l’activité méthyltransférase de PRDM9 pour la détermination des sites de recombinaison méiotique et plus généralement pour la progression de la méiose et finalement la formation de gamètes chez la souris.

In sexually reproducing organisms, gametes are produced by a process comprising two successive division, called meiosis. During the first division, meiotic recombination enables a physical contact and an exchange of genetic material between homologous chromosomes. Meiotic recombination results from the repair, by homologous recombination, of programmed DNA double-strand breaks (DSBs) catalyzed by the SPO11 protein at the beginning of prophase I. In mammals, recombination events are localized in 1 to 2 kb-long regions called recombination hotspots. PRDM9, a PR/SET domain and zinc finger-containing protein, determines hotspot localization by targeting specific DNA sequences through its zinc finger array. Notably, PRDM9 PR/SET-domain possesses an H3K4 methyltransferase activity, while PRDM9-dependent H3K4me3 enrichment is found at hotspots in spermatocytes.We aimed at characterizing PRDM9 methyltransferase activity and studying its role in meiotic recombination initiation in mouse. The crystal structure of PRDM9 PR/SET domain, which we generated in complex with a histone H3 peptide, shows that this domain adopts a similar topology to that of classical SET domains and allowed us to identify key residues for its catalytic activity. PRDM9 PR/SET domain catalyzes not only mono-, di- and trimethylation of H3K4, but also of H3K9 and H3K36. We confirmed PRDM9 dependent H3K36 trimethylation in spermatocytes. Taking advantage of the distinct DNA binding specificity of two Prdm9 alleles, Prdm9b and Prdm9wm7, each activating its own set of hotspots, we generated transgenic mouse lines expressing either Prdm9wm7G278A or Prdm9wm7Y357F mutant allele together with the endogenous wild-type Prdm9b allele. Both G278A and Y357F mutations abolish PRDM9 catalytic activity. We show that PRDM9wm7Y357F binds normally to its genomic targets, but is not able to promote H3K4 nor H3K36 trimethylation at these sites. In addition, PRDM9wm7Y357F does not promote recombination at one Prdm9wm7-dependent hotspot, showing that PRDM9 catalytic activity is required for promoting recombination at hotspots. In mice expressing only the mutant allele (Prdm9wm7G278A or Prdm9wm7Y357F), spermatocytes display defects in homologous chromosome synapsis and DSBs repair, as well as an arrest of meiosis at the mid-prophase I. This phenotype is similar to that of Prdm9 KO mice. Overall, our results demonstrate the role of PRDM9 methyltransferase activity in determining recombination hotspots and more generally for meiotic progression and gametes formation.