Rôle des cellules endothéliales JAK2V617F dans l’augmentation de l’angiogenèse des néoplasies myéloprolifératives.

Role of JAK2V617F endothelial cells in the increase of angiogenesis in myeloproliferative neoplasms.

• Auteur / Autrice : Badr Kilani
• Direction : Chloé James
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et physiopathologie
• Date : Soutenance le 18/12/2015
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Bordeaux)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Biologie des maladies cardiovasculaires (Pessac, Gironde)
• Jury : Président / Présidente : Thierry Couffinhal
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : François-Xavier Mahon, Valérie Ugo
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Pascale Gaussem, Jean-Luc Villeval

Mots clés

Mots clés contrôlés

Ischémie

Souris transgéniques

Cellules endothéliales

Tumeurs -- Vaisseaux sanguins

Néovascularisation

Mots clés libres

Néoplasies myéloprolifératives

Angiogenèse

Cellules endothéliales

Mutation JAK2V617F

Souris transgéniques

Cre recombinase

Myeloproliferative neoplasms

Angiogenesis

Endothelial cells

JAK2 V617F mutation

Transgenic mice

Cre recombinase

Résumé

Les néoplasies myéloprolifératives (NMP) sont des maladies hématologiques acquises de la cellule souche hématopoïétique. Une mutation activatrice de la protéine de signalisation JAK2, JAK2V617F, a été identifiée chez la moitié des patients atteints de NMP Philadelphie négatives. Il a été rapporté que les patients avec des NMP avaient une augmentation du risque thrombotique et de la densité microvasculaire dans la rate et la moelle osseuse, sans explication physiopathologique claire. Des travaux récents ont mis en évidence la présence de la mutation JAK2V617F non seulement dans les cellules sanguines mais également dans les cellules endothéliales (CE) de ces patients. Nous faisons l’hypothèse que la présence de JAK2V617F dans les CE pourrait modifier leurs propriétés expliquant l’augmentation de l’angiogenèse dans les NMP. Pour répondre à cette hypothèse, nous avons voulu étudier le phénotype angiogénique des cellules endothéliales portant la mutation JAK2V617F. In vitro, nous disposons des particules lentivirales permettant d’obtenir des CE JAK2V617F par transduction lentivirale. In vivo, nous disposons des souris transgéniques exprimant la mutation JAK2V617F de manière conditionnelle (JAK2V617F/WT) grâce à la stratégie Cre-lox. Pour répondre à notre hypothèse, il été nécessaire de travailler avec des modèles murins exprimant la mutation JAK2V617F spécifiquement dans les CE sans atteinte concomitante de la lignée hématopoïétique. Dans un premier temps, nous avons voulu caractériser deux modèles endothéliaux inductibles couramment utilisés, Cdh5(PAC)-CreERT2 et Pdgfb-iCreERT2, en termes d’efficacité et de spécificité de recombinaison dans les cellules endothéliales vis-à-vis du compartiment hématopoïétique. Nous avons démontré que les souris adultes Cdh5(PAC)-CreERT2 pouvaient être utilisées comme modèles endothéliaux spécifiques, avec toutefois la mise en garde que la recombinaison est très variable entre les souris. Nous avons constaté que les souris PDGFB-iCreERT2 sont appropriées pour cibler les cellules endothéliales dans une large gamme d’organes à l'exception du foie, et devraient être utilisées dans les quatre premières semaines qui suivent l'induction, pour cibler un gène d’intérêt au niveau des cellules endothéliales, sans qu’il ait une atteinte concomitante dans la lignée hématopoïétique. Nous avons ensuite étudié les propriétés angiogéniques des cellules endothéliales JAK2V617F, in vitro en utilisant des HUVEC transduites avec un lentivirus permettant l’expression de JAK2V617F, et in vivo avec les souris Pdgfb-iCreERT2;JAK2V617F/WT. Nous avons démontré que les HUVEC JAK2V617F avaient un profil proangiogénique lié à une capacité proliférative élevée, résultant de l’activation de la voie JAK2/STAT3/PI3K. L’avantage hyperprolifératif que confère la mutation JAK2V617F aux cellules endothéliales a été confirmé in vivo avec le modèle de la vascularisation post-natale de la rétine, avec toutefois une diminution de la densité du réseau vasculaire due à une augmentation de la régression vasculaire au niveau de la rétine des souris Pdgfb-iCreERT2;JAK2V617F/WT.

Myeloproliferative neoplasms (MPNs) are acquired hematopoietic stem cell disorders. An activating mutation in the JAK2 signaling protein, JAK2V617F, was identified in half of the patients with Philadelphia chromosome-negative MPNs. It has been reported that patients with MPN had an increased risk of thrombosis but also an increased microvessel density in the spleen and bone marrow with no clear pathophysiological explanation. Several recent studies have demonstrated the presence of JAK2V617F mutation not only in blood cells but also in endothelial cells (EC) in MPN patients. We hypothesized that the presence of JAK2V617F in EC could change their properties leading to an increased angiogenesis process in MPNs. To address this question, our aim was to study the angiogenic phenotype of endothelial cells carrying the JAK2V617F mutation. For the in vitro experiments, we used lentiviral transduction of human JAK2V617F in EC. For the in vivo approach, we used transgenic mice (JAK2V617F/WT) that conditionally express JAK2V617F through Cre-lox strategy. To investigate our hypothesis, it was necessary to work with mice that express JAK2V617F specifically in EC without concomitant expression in hematopoietic cells. We first characterized two commonly-used inducible endothelial models, Cdh5(PAC)-CreERT2 and Pdgfb-iCreERT2, in terms of efficiency and specificity of recombination in endothelial cells. We showed that adult Cdh5(PAC)-CreERT2 mice can be used as specific endothelial model with however the wariness that recombination is highly variable among mice. We found that Pdgfb-iCreERT2 mice are appropriate to target endothelial cells in a wide range of organs except liver, and should be used within the four weeks after induction of Cre-mediated recombination to target a gene of interest in endothelial cells, without having a concomitant expression in hematopoietic lineage. We then studied the angiogenic properties of JAK2V617F endothelial cells, in vitro using JAK2V617F transduced HUVECs, and in vivo using Pdgfb-iCreERT2;JAK2V617F/WT mice. We observed that JAK2V617F HUVECs had a proangiogenic profile that was related to a highly proliferative potency, and that this phenotype results from a constitutive activation of JAK2/STAT3/PI3K pathway. The hyperproliferative advantage conferred by JAK2V617F to endothelial cells was confirmed in vivo using the postnatal vascularization model of the retina, with however a decrease in the density of the vascular network due to an increased vascular regression in Pdgfb-iCreERT2;JAK2V617F/WT mice’s retinas.