Interactions hôte-pneumocystis : études fonctionnelle de la PcMnSOD et de la colonisation par pneumocytsis spp par des approches expérimentales et clinico-épidémiologiques

Host-Pneumocystis interactions : PcMnSOD functional study and evaluation of Pneumocytsis spp colonization by experimental and clinico-epidemiological approaches

• Auteur / Autrice : Sara Khalife
• Direction : El Moukhtar Aliouat, Monzer Hamze
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Parasitologie et mycologie
• Date : Soutenance le 29/09/2014
• Etablissement(s) : Lille 2 en cotutelle avec École doctorale des Sciences et de Technologie (Beyrouth)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie-Santé (Lille ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre d'infection et d'immunité de Lille
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Monzer Hamze

Mots clés

Mots clés contrôlés

Superoxide dismutase

Dissertations universitaires

Pneumocystis carinii

Superoxyde dismutase

Bronchopneumopathies obstructives

Immunosuppression

Pneumocystose

Pneumocystis carinii

Mots clés libres

Colonisation par pneumocystis

Risque infectieux

Expression hétérologue

Saccahromices cerevisae

Choc oxydant

Bronchopneumopathie obstructive

Immunosuppression

Bronchopneumonias

Dismutase, superoxide

Pneumocystis

Résumé

Le genre Pneumocystis regroupe des microchampignons atypiques qui colonisent par voie respiratoire les alvéoles pulmonaires de nombreux mammifères. C’est un pathogène opportuniste qui s’avère particulièrement dangereux lorsque le système immunitaire de l’hôte est déficient (VIH, greffés) et dans ce cas il provoque une pneumonie, la pneumocytsose, fatale en absence de traitement. Du fait que les Pneumocystis spp restent des microchampignons non cultivables, il est alors impossible de manipuler directement ses gènes et la seule solution pour étudier leurs fonctions et leurs localisations, demeure leur expression en système hétérologue. Situé dans l'espace alvéolaire, Pneumocystis spp. sont exposés au stress oxydatif générés par les macrophages alvéolaires, les granulocytes neutrophiles ainsi que par les espèces réactives de l'oxygène (EROs) produits par le métabolisme respiratoire. Pour se protéger, ces micro-organismes ont développé un système spécifique de détoxification des EROs incluant les SuperOxyde Dismutases (SOD). Dans notre étude, la carence en MnSOD d'une souche de Saccharomyces cerevisiae (EG110) dépourvue du gène Scsod2 a été complétée par l'introduction d'un plasmide portant une version inductible du gène Sod2 de P. carinii (Pcsod2). Une fois exprimée la PcMnSOD était capable de complémenter le défaut de croissance de la souche EG110 qui a été exposés à la ménadione. En bref, notre étude a montré une bonne complémentation du gène Sod2 de P. carinii chez une levure déficiente en MnSOD à savoir (i) la reprise de la culture en conditions de stress oxydant, (ii) la mise en évidence de la protéine traduite (Western Blot) et (iii) l’adressage mitochondriale de la protéine hétérologue. Selon le degré d’altération du système immunitaire, les infections à P. jirovecii peuvent présenter des tableaux cliniques variés allant de la colonisation à la pneumocystose. Ces infections semblent être en grande partie liées à des déficits majeurs de l’immunité cellulaire se traduisant plus précisément par une diminution du nombre des lymphocytes TCD4 (LTCD4). Notre deuxième objectif était de parvenir à une appréciation quantitative du risque de contamination par P. carinii en fonction du degré d’immunodépression (ID) des rats exposés. Nous avons ainsi développé un modèle animal de transmission naturelle de P. carinii où des rats nude développant une pneumocystose (« rats donneurs ») sont mis en contact direct avec des rats Sprague Dawley Pneumocystis-free (« rats receveurs ») présentant différents niveaux d’ID (dexamethasone). Après 2 semaines de contact, le niveau de colonisation des rats graduellement ID est déterminé soit par comptage après coloration au Bleu de Toluidine O, soit par qPCR. Cette étude a permis tout d’abord de valider notre modèle d’ID graduelle chez le rat ; mais surtout, et pour la première fois dans un modèle expérimentale chez le rat, nous avons montré une relation inverse entre le niveau de colonisation par P. carinii et le taux de LTCD4 ou LTCD8 circulants. Enfin, nous avons réalisé la première étude épidémiologique portant sur Pneumocystis au Liban. Ce projet franco-libanais a été mis en place au vue de l’importance majeure de la colonisation par Pneumocystis chez les patients immunocompétents, en particulier chez les patients atteints de pathologies pulmonaires chroniques obstructives tels que la BPCO où la colonisation par Pneumocystis est considérée comme un facteur aggravant de la maladie. Nos résultats montrent une faible prévalence de colonisation (5.2%) et une prédominance du génotype mtLSU2 chez les patients atteints de pathologies respiratoires au Liban. De plus, dans notre cohorte de patient présentant des pathologies respiratoires variées, la BPCO semble être la seule maladie respiratoire associée à un facteur de risque de colonisation par P. jirovecii.

Pneumocystis is an opportunistic pulmonary fungal pathogen that causes Pneumocystis pneumonia (PcP) in immunocompromised individuals such as patients with HIV infection as well as those without HIV infection who are undergoing immunosuppression as a consequence of chemotherapy or organ transplantation. Pneumocystis colonization in immunocompetent individuals has recently been described by the detection of fungal DNA without signs or symptoms of pneumonia, and accumulating evidences underline its clinical importance. Pneumocystis organisms are airborne transmitted and represent a large group of species of atypical fungi that cannot be continuously grown in culture. Consequently, it is impossible to directly manipulate genes in Pneumocystis species. Located in the alveolar space, Pneumocystis organisms are exposed to oxidative burst from phagocytic alveolar macrophages and neutrophils as well as to reactive oxygen species (ROS) produced by the mitochondrial oxygen metabolism. To counteract this, microorganisms have developed a ROS detoxifying system. This includes superoxide dismutases (SOD). In the present study, the MnSOD deficiency of a Saccharomyces cerevisiae mutant strain was complemented by introducing a plasmid carrying an inducible version of the P. carinii Sod2 gene (Pcsod2). Expression of Pcsod2 revealed that the corresponding MnSOD recombinant protein could complement the growth defect in the mutant yeast strain when cells were exposed to menadione. The mitochondrial localization was confirmed by immuno-colocalization of the P. carinii recombinant MnSOD with the yeast mitochondrial Cox4 protein. These results suggest that Pcsod2 encodes an active MnSOD that is targeted to the mitochondrion. This work increases our understanding of the antioxidant defense mechanisms deployed by the Pneumocystis organisms.The adaptive host response to Pneumocystis infection involves humoral and cellular immune responses working in concert to promote the clearance of infection. Depending on the degree of alteration of the immune system, Pneumocystis infections may have various clinical presentations going from colonization to the most severe form (PcP).These infections appear to be largely related to major deficits in cellular immunity and are more closely reflecting a decrease in the number of CD4 T lymphocytes (LTCD4). Our objective was to achieve a quantitative assessment of the risk of contamination by Pneumocystis depending on the degree of immunosuppression (ID) of the exposed host. Thus, we developed an animal model of natural transmission of P. carinii where rats undergoing gradual ID (dexamethasone) named receivers, are cohoused with nude rats developing PcP, named donors. Following contact between receiver and donor rats, the level of colonization by Pneumocystis of receiver rats is determined by toluidine blue O staining or by qPCR. This study allowed us to validate our gradual ID rat model, in the sense that we were able to maintain the level of circulating LTCD4 and LTCD8 stable. Finally, and for the first time in an experimental rat model, we observed an inverse relationship between the level of colonization by P. carinii and the level of circulating LTCD4 and LTCD8.Finally, we aimed to acquire the first data concerning the prevalence of P. jirovecii in the Lebanese population. This Franco-Lebanese project was set up because the colonization by Pneumocystis is probably of major importance in the public health, especially in susceptible patients such as patients with chronic obstructive pulmonary diseases (COPD) where Pneumocystis is considered as a worsening prognosis factor. Our results show a low prevalence of P. jirovecii colonization (5.2%) and the predominance of mtLSU genotype 2 in patients with respiratory diseases in Lebanon. Moreover, in our cohort of patients with various respiratory diseases, COPD was the only respiratory disease associated with a significant increased risk of P. jirovecii colonization.