Insights into the RNA polymerase activity of the dengue virus NS5

• Auteur / Autrice : Supanee Potisopon
• Direction : Bruno Canard, Barbara Selisko
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Pathologie humaine. Maladies infectieuses
• Date : Soutenance le 04/07/2014
• Etablissement(s) : Aix-Marseille
• Ecole(s) doctorale(s) : École Doctorale Sciences de la Vie et de la Santé (Marseille)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Architecture et Fonction des Macromolécules Biologiques (AFMB) (Marseille)
• Jury : Président / Présidente : Jean-Claude Guillemot
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Bruno Canard, Barbara Selisko, R. Pad Padmanabhan, Ali Amara, Julien Lescar
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : R. Pad Padmanabhan, Ali Amara

Mots clés

Mots clés contrôlés

Génome viral

génétique

Virus de la dengue

Protéines virales non structurelles

Initiation de la transcription

Élongation de la transcription

RNA replicase

biosynthèse

ARN

Mots clés libres

Mot clés : virus de la dengue

Ns5

Polymérase

Méthyltransférase

Synthèse de l'ARN

Réplication

Dengue virus

Ns5

Polymerase

Methyltransferase

RNA synthesis

Replication

Résumé

Le virus de la dengue cause une maladie de type grippal qui peut dans certains cas évoluer vers des fièvreshémorragiques mortelles. Mon projet de thèse porte sur la réplication de ce virus. Je focalise sur la compréhension du mécanisme d'action de la protéine NS5 de ce virus. La protéine contient 2 domaines : 1) domaine méthyltransférase, essentiel pour la traduction des protéines virales, 2) domaine polymérase, synthétisant le génome ARN du virus. Premièrement, nous avons démontré que la polymérase joue un rôle principal dans la conservation de l'extrémité 3' et 5' du génome et de l'anti-génome. Puis, j'ai caractérisé l'influence du domaine méthyltransférase sur l'activité polymérase de la protéine NS5. J'ai développé un système d'études mécanistiques en utilisant des techniques biochimiques de cinétique pré-stationnaire pour la protéine NS5, et obtenu des paramètres cinétiques et thermodynamiques de cette protéine envers ses substrats. Avec ce même système, j'ai pu tester des activités de la polymérase NS5 avec des ARN coiffés et triphosphates de différente longueur, mimant les séquences à l'extrémité 5' du génome du virus de la dengue. L'activité polymérase de NS5 est influencée par la présence de la coiffe de l'ARN, ce qui m'a permis de proposer une distance physique correspondant à environ 13 nucléotides entre les sites actifs domaines méthyltransférase et polymérase. Mes travaux ouvrent la voie à la détermination de la structure 3D de NS5 avec ses ARN et des nucléotides 5'-triphosphate.Elucider son mécanisme d'action, c'est être capable d'inhiber son action et donc de pouvoir proposer des molécules capables d'arrêter la prolifération virale lors d'une infection.

Dengue virus causes dengue fever, which may evolve towards life-threatening hemorrhagic fever. My research projectfocuses on dengue replication, and more precisely on the mechanism of NS5 at the molecular/atomic level. NS5 is a bifunctionalenzyme containing two domains: 1) a methyltransferase domain essential for translation of viral proteins, 2) apolymerase domain synthesizing the viral RNA genome. First, we demonstrated the main role of the polymerase in theconservation of 5' and 3' ends of dengue genome and anti-genome RNAs. Next, I showed the influence of themethyltransferase domain on the activity of the polymerase domain. I also developed a system allowing mechanistic studiesusing pre-steady state kinetics to characterize NS5 in depth. I have made use of this system to determine the catalyticparameters of NS5 towards its substrates. Using the same pre-steady state system, I was able to test the polymerase activityof NS5 with capped and uncapped 5'-triphosphate RNAs of different lengths corresponding to the 5'-end of the dengue RNAgenome. The polymerase activity of NS5 is significantly affected by the presence of the 5'-cap, which allowed me to designan experimental set-up pointing to a minimal physical distance of around 13 nucleotides between the methyltransferase andpolymerase active sites. My work will be useful to characterize the biophysics of NS5 in complex with its RNA and NTPsubstrates, and then to determine the crystal structure of such complex at play during viral RNA synthesis. Knowing thedetailed NS5 mechanism paves the way to inhibit its action and thus design drugs aiming at stopping a viral infection.