Mécanismes contrôlant la tolérance immunologique vis-à-vis des auto-antigènes exprimés par le muscle squelettique

• Auteur / Autrice : Emilie Franck
• Direction : Sahil Adriouch, Olivier Boyer
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Immunologie
• Date : Soutenance en 2012
• Etablissement(s) : Rouen
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Normande de biologie intégrative, santé, environnement (Mont-Saint-Aignan, Seine-Maritime)
• Jury : Président / Présidente : François Tron
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Serge Herson, Benoît Salomon, Jean Davoust, Sylvain Fisson

Mots clés

Mots clés contrôlés

Tolérance immunitaire

Thérapie génique

Polymyosite

Autoimmunité

Thérapie génique

Résumé

Sur le plan fondamental, les mécanismes contrôlant la mise en place et le maintien de la tolérance immunologique vis-à-vis du tissu musculaire, représentant 30 à 40% de la masse corporelle, sont encore mal connus. Afin de mieux appréhender les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la tolérance aux auto-antigènes musculaires, des souris transgéniques exprimant une forme membranaire d'un antigène modèle (Ova pour Ovalbumine) dans le muscle squelettique ont été obtenues dans le laboratoire (souris nommées SM-Ova pour Skeletal Muscle-Ova). Les souris SM-Ova, se sont révélées être incapables de rejeter des tumeurs exprimant l’Ova, en lien avec une absence de cellules CD8+ dirigées contre l’Ova suite à l’immunisation de ces animaux avec différents vecteurs recombinants pour l'Ova. Ainsi, nous avons évalué l’hypothèse d’une délétion périphérique sélective des clones CD8+ anti-Ova. Des expériences de transfert adoptif de cellules CD8+ anti-Ova (cellules OT-I CD45. 1+) ont permis de démontrer formellement la délétion progressive de ces cellules du répertoire périphérique des souris receveuses SM-Ova CD45. 2. Il a également été démontré que la délétion périphérique des cellules CD8+ anti-Ova était corrélée à l’expression de PD-1 à la surface de ces cellules et à la diminution de l’expression du facteur anti-apoptotique Bcl-2. De manière intéressante, cette élimination clonale en périphérie dans l’environnement des souris SM-Ova s’applique également vis-à-vis de cellules OT-I CD45. 1+ activées in vivo. En effet, les cellules OT-I CD45. 1+ révèlent, 15 et 21 jours après transfert adoptif chez les souris SM-Ova immunisées avec le Lm-Ova, une contraction clonale accélérée, une capacité moindre à sécréter des cytokines pro-inflammatoires telles que l’IFN-ou le TNF-_, une habilité moindre à se différencier en cellules mémoires à longue durée de vie et ce, dans le contexte d'une élimination progressive et continue de ces cellules en périphérie comparativement à la lignée contrôle B6. Par ailleurs, la réponse CD4+, caractérisée indirectement au travers de l’apparition d’IgG anti-Ova ainsi que par une réaction d'hypersensibilité retardée à l'Ova, chez les souris SM-Ova immunisées en CFA-Ova, sont similaires à celles de la lignée sauvage B6. Ces résultats, impliquent ainsi un mécanisme original de tolérance « asymétrique » affectant les LT CD8+ mais pas les LT CD4+. Par ailleurs, nous nous sommes intéressés à caractériser le facteur pro-apoptotique impliqué dans la délétion périphérique des LT CD8+; la voie des récepteurs de mort Fas/Fas-L a ainsi été évaluée. Les expériences de transfert adoptif de cellules OT-I FasLpr/Lpr et l'immunisation des souris SM-Ova FasLpr/Lpr n'ont pas permis de prévenir l'élimination en périphérie des cellules OT-I ou de restaurer la réponse CD8+ anti-Ova dans les souris SM-Ova. Ces résultats invalident alors un rôle majeur de Fas dans la délétion périphérique des LT CD8+ anti-Ova "naïfs". En revanche, la perte d'expression de Fasdans les cellules OT-I FasLpr/Lpr prévient la contraction clonale accélérée de ces cellules s'illustrant par une fréquence plus élevée de cellules OT-I FasLpr/Lpr chez les souris SM-Ova 15 jours après transfert et immunisation comparativement aux souris B6. Ces résultats indiquent alors une coopération de Fas dans l'élimination clonale de clones auto-réactifs activés. Dans un second temps, dans le cadre d'une collaboration avec l'Inserm U955 (R. Ghérardi, Créteil), nous avons contribué à montrer que les lésions musculaires favorisaient la prolifération des LT CD8+ dans les ganglions drainants en réponse à des antigènes exprimés par le tissu musculaire lésé. Des DCs dérivant des monocytes (moDCs), se distinguant des DCs conventionnelles, participent au recrutement et à l'expansion locale des LT CD8+ bien que ces dernières ne soient pas impliquées directement dans l'activation des LT CD8+ dans les ganglions. Par ailleurs, malgré une lésion mécanique, la présence de fibres musculaires en régénération exprimant les molécules du CMH-I et la présence d'un infiltrat inflammatoire, la rupture de tolérance conduisant au développement d'une myosite dans les souris SM-Ova n'est pas observée. De même, la rupture de tolérance vis-à-vis du muscle squelettique n'est pas observée dans les souris SM-Ova malgré la présence d'une inflammation systémique et d'un grand nombre de LT CD8+ et/ou CD4+anti-Ova. Ainsi, le muscle se révèle être un tissu particulièrement résistant au développement d'une maladie auto-immune. En dernier lieu, outre nos travaux, de nombreuses études suggèrent que l’expression de la molécule immuno-régulatrice PD-1 à la surface des LT CD8+ corrèle avec l’induction de leur anergie/délétion et laisse entrevoir un rôle important de l’axe PD-1/PD-L dans l’induction et le maintien de la tolérance immunologique. Fort des résultats obtenus dans le modèle SM-Ova, nous avons souhaité évaluer l’impact de la surexpression de PD-L1 ou PD-L2 dans le muscle squelettique sur l’induction et le maintien d’une tolérance durable aux protéines transgéniques dans le contexte de la thérapie génique. Pour cela, des AAV2/1-Ova, AAV2/1-PD-L1 et AAV2/1-PD-L2 ont été construits au laboratoire et produits par notre laboratoire partenaire (A. Salvetti, Lyon). Ils ont ensuite été utilisés dans des conditions mimant la thérapie génique en réalisant l’injection intramusculaire de ces vecteurs chez la souris. Le rôle immuno-régulateur de PD-L1 ou PD-L2, co-transféré dans le muscle squelettique au même moment que le transfert du gène codant pour l’Ova, a été évalué en mesurant les réponses immunitaires dirigées contre l’Ova au cours du temps et en évaluant la persistance de l’expression de l’Ova dans le muscle injecté 60 et 80 jours après transfert de gène. Les résultats obtenus, démontrent que les AAV-PD-L, bien qu’incapables d’inhiber l’expansion initiale des LT CD8+ anti-Ova et la réponse anticorps anti-Ova, sont capables de prolonger l’expression de l’Ova dans le muscle traité notamment lorsque ce vecteur est utilisé en synergie avec un traitement immunosuppresseur tel que CTLA-4/Fc. En conclusion, l'effet synergique et non-redondant de CTLA-4/Fc et des rAAV2/1-PD-L peut constituer une approche intéressante pour améliorer la persistance à long terme des protéines transgéniques dans le cadre de la thérapie génique. En conclusion, ce travail a mis en lumière que le muscle squelettique apparaît différent au regard de la tolérance immunologique en se montrant hautement réfractaire au développement d'une atteinte auto-immune. La résistance du muscle squelettique à l'attaque cytotoxique orchestrée par les LT CD8+ dans le modèle SM-Ova est à mettre en parallèle avec le caractère très rare de la polymyosite, pathologie considérée comme une maladie auto-immune vis-à-vis d'antigènes musculaires. D'autre part, la délétion périphérique des LT CD8+ anti-Ova corrélée à l'expression de la molécule PD-1 chez les souris SM-Ova a permis de mettre à profit l'axe PD-1/PD-L dans l'induction d'une tolérance à long terme vis-à-vis des protéines transgéniques dans une situation thérapeutique mimant un arrêt du traitement immunosuppresseur, dans le cadre de la thérapie génique.