Caractérisation des GTPases Rab5 de Plasmodium

Characterization of the three GTPases Rab5s in Plasmodia parasites

• Auteur / Autrice : Carinne Prisca Ndjembo Ezougou
• Direction : Jean Dupouy-Camet
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie. Génétique et immunologie des infections parasitaires
• Date : Soutenance en 2011
• Etablissement(s) : Paris 7

Mots clés

Mots clés contrôlés

Interactions hôte-parasite

Membrane érythrocytaire

Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases

Transport biologique

Protéines G rab5

Plasmodium falciparum

Résumé

Plasmodium, protozoaire parasite intracellulaire obligatoire, est inoculé à l'Homme par piqûre de moustiques (Anophèles), Le parasite se développe dans le foie (phase hépatique) puis dans les globules rouges (phase érythrocytaire). Cette phase, symptomatique de la maladie, est l'objet de notre étude. Pour assurer sa survie, il est donc indispensable que le parasite mette en place un trafic vésiculaire pour, d'une part, importer des nutriments (comme l'hémoglobine éryhtocytaire) et, d'autre part, exporter des protéines et des produits de dégradation à la surface et en dehors du globule rouge. L'étude des protéines responsables de la régulation du trafic vésiculaire est donc essentielle à la compréhension des mécanismes de survie du parasite. Les protéines Rab jouent un rôle majeur dans la régulation du transport vésiculaire des cellules eucaryotes. Il existe trois isoformes Rab5 chez Plasmodium : Rab5A, Rab5B et Rab5C et ce projet vise à les étudier spécifiquement. Des résultats précédents obtenus au sein de notre laboratoire ont mis en évidence chez Plasmodium une voie d'importation de l'hémoglobine impliquant Rab5A. Au cours de ce projet, nous avons donc étudié la participation des GTPases Rab5 dans le développement de Plasmodium, notamment leur implication au cours du processus d'incorporation de l'hémoglobine érythocytaire. Nous avons montré que les gènes rab5b et rab5c sont essentiels pour le développement du parasite au cours de la phase érythrocytaire. Nous avons observé Rab5C associée à l'hémoglobine et à la vacuole digestive (site de dégradation de l'hémoglobine). Nos résultats suggèrent que les vésicules d'hémoglobine endocytées sont d'abord Rab5A (+), Rab5C prendrait en charge par la suite ces vésicules en permettant leur fusion avec la vacuole digestive. Nos résultats montrent que Rab5B ne semble pas intervenir dans ce processus. Nous avons par la suite proposé un interactome des GTPases Rab5 de Plasmodium par homologie avec celui des trois orthologues Ypt51, Ypt52 et Ypt53 de Saccharomyces cerevisiae. Nous avons testé certaines prédictions entre les Rab5 et les sous-unités (régulatrice (R) et catalytique (C)) de la PKA (Protéine Kinase A, AMPc-dépendante). Nous avons montré que Rab5A interagit physiquement avec la PKA-C et la PKA-R, in vitro et in vivo, alors que Rab5B interagit physiquement avec la PKA-R. Rab5C semble interagir avec la PKA-R, mais de manière indirecte. Nous avons montré que l'incorporation de l'hémoglobine est partiellement PKA-dépendante. Nos résultats suggèrent que Rab5A recruterait la PKA aux endosomes précoces, où la PKA pourrait phosphoryler certaines «actin-binding proteins » spécifiquement, qui moduleraient par la suite le dynamisme de l'actine.

Plasmodium, an obligatory intracellular parasitic protozoan, is inoculated to human by mosquitoes bite (Anopheles). Parasite develops in the liver (hepatic stage), and then in red blood cells (erythrocytic stage). This stage, symptomatic of illness, is the subject of our study. To assure its survival, parasite sets up a vesicular transport in order, on one hand, to import nutrients (as erythrocytic hemoglobin) and, on the other hand, to export proteins and degradation products at the surface of red blood cell. The study of proteins responsible for the regulation of vesicular is therefore essential in order to understand mechanisms of parasite's survival. Proteins Rab play a key role in the regulation of vesicular transport of eukaryotic cells. Plasmodium has three isoforms of RabS: RabSA, RabSB and RabSC. In this present project, we were interested to study them specifically. Previous results acquired at our laboratory show that there is a pathway of hemoglobin uptake implicating RabSA. We therefore studied the participation of GTPases RabS in parasite development, notably their involvement in hemoglobin uptake. We showed that rab5b and rabSc gènes are essential for parasite development during its erythrocytic stage. We observed RabSC associated with hemoglobin and with food vacuole (organelle where hemoglobin is degraded). Our results suggest that incorporated vesicles of hemoglobin are RabSA (+) first, then RabSC would transport these vesicles later by allowing their fusion with food vacuole. Our results show that RabSB does not seem to intervene in this process. We proposed an interactome of GTPases RabS of P. Falciparum by homology with the one of its three orthologous of Saccharomyces cerevisiae (YptSl, Ypt52 and Ypt53). We tested predictions between RabS and sub-units (regulatoty (R) and catalytic (C)) of PKA (Protein Kinase A, AMPc-dependent signaling pathways). We showed that RabSA interacts physically with PKA-C and PKA-R, in vitro and in vivo, while RabSB interacts physically with PKA-R. RabSC seems to interact with PKA-R, but indirectly. We showed that hemoglobin uptake is partially PKA-dependent. Our results suggest that RabSA would recruit PKA at early endosomes, where PKA could phosphorylate some «actin-binding proteins» specifically, which would modulate actin dynamic. It's also predicted in this interactome that Casein Kinase 1 (CK1) could interact physically with RabSs. Our results showed that only RabSB could interact physically with CK1. RabSB doesn't hâve isoprenylation's motif at its C-terminal part (modification allowing Rab to anchoring to membranes). We noticed that RabSB has motifs of myristoylation and palmitoylation at its N-terminal part. In vitro N-myristoyl Transferase (NMT) assays are under way of realization. We think that by this way, RabSB (+) vesicles could transport "freighters" towards the membrane (for example plasma membrane of the parasite). By its hypothetic function of "conveyor" of freighters towards plasma membranes, RabSB could also intervene in various important processes for parasite development, as invasion of red blood cells, what would explain why rabSb gene is essential.