Caractérisation biochimique et fonctionnelle de glutathion-S-transferases (GSTs) chez Phanerochaete chrysosporium

Biochemical and functional characterization of glutathione Stransferases (GSTs) in Phanerochaete chrysosporium

• Auteur / Autrice : Andrew Anak Ngadin
• Direction : Éric Gelhaye, Mélanie Morel
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie végétale et forestière
• Date : Soutenance le 25/05/2011
• Etablissement(s) : Nancy 1
• Ecole(s) doctorale(s) : RP2E - Ecole Doctorale Sciences et Ingénierie des Ressources, Procédés, Produits, Environnement
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Interactions Arbres Micro-organismes (Nancy)
• Jury : Président / Présidente : Daniel Wipf
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Patrick Billard, Anissa Lounès-Hadj Sahraoui, Michel Penninckx

Mots clés

Mots clés contrôlés

Physiologie

Basidiomycètes

Composés aromatiques polycycliques

Xénobiotiques

Glutathion S-transférase

Mots clés libres

Phanerochaete chrysosporium

Glutathion S-transferases

Omega

Ure2p

Xenobiotiques

Hydrocarbures aromatiques polycycliques

Phanerochaete chrysosporium

Glutathione S-transferases

Omega class

Ure2p class

Xenobiotics

Polycyclic aromatic compounds

Résumé

Phanerochaete chrysosporium est un champignon ligninolytique largement étudié pour ses capacités à dégrader la lignine et certains xénobiotiques grâce à un important système d'enzymes extracellulaires. Son génome est entièrement séquencé et constitue un inventaire de séquences protéiques prédites qui a permis la description de nombreuses superfamilles de protéines. Parmi elles, les Glutathion S-transférases sont essentiellement impliquées dans le métabolisme secondaire du champignon. Cependant, malgré les nombreux travaux montrant l'implication de ces enzymes dans la réponse aux stress, le développement cellulaire et plus globalement dans certaines fonctions métaboliques, leurs réelles fonctions restent inconnues à cause de leur grande diversité et le manque de données concernant leurs spécificités catalytiques. P. chrysosporium possède 27 isoformes de GSTs qui se regroupent en 7 classes. Parmi elles, 3 sont étendues chez les champignons saprophytes : les classes Omega, Ure2p et ethérase. Deux membres de la classe Omega ont été caractérisés au niveau biochimique et montrent desspécificités de substrat. En effet, PcGTO1 fait partie d'une nouvelle classe appelée S-glutathionyl-phydroquinone reductase, alors que PcGTO3 est plutôt active avec le phenylacetophenone. La structure tridimensionnelle de PcGTO1 suggère que l'enzyme appartient également à une nouvelle classe structurale que nous avons appelée xi. La deuxième classe majoritaire que nous avons étudiée est la classe des Ure2p qui est composée de 9 isoformes et se regroupent en 2 sous-classes. Trois isoformes ont été étudiées au niveau transcriptionnel, biochimique et physiologique. PcUre2p4 et PcUre2p6 appartenant à la première sous-classe sont spécifiquement exprimés dans des cultures fongiques en présence d'hydrocarbures aromatiques polycycliques et l'activité des protéines recombinantes correspondantes est classique des GSTs à savoir le transfert de glutathion sur un substrat hydrophobe. A l'inverse, PcUre2p1 qui appartient à la deuxième sous-classe est exprimé de manière constitutive au niveau transcriptionnel et la protéine présente une activité thiol transférase comparable aux protéines de la classe Omega. Les analyses physiologiques menées grâce à la complémentation de souche déficience de Saccharomyces cerevisiae ont montré que PcUre2p1, PcUre2p4 et PcUre2p6 n'avaient pas la même fonction que l'isoforme de la levure puisqu'aucune complémentation n'a été détectée en ce qui concerne la résistance au stress ou la régulation du métabolisme azoté. Ces résultats suggèrent que leschampignons, en particulier ceux qui présentent des propriétés saprophytes ont développé des spécificités de fonction de leur GSTs probablement en réponse à des contraintes environnementales.

Phanerochaete chrysosporium is a ligninolytic fungus widely studied because of its capacities to degrade wood and xenobiotics through an extracellular enzymatic system. Its genome has been sequenced and has provided researchers with a complete inventory of the predicted proteins produced by this organism. This has allowed the description of many protein superfamilies. Among them, Glutathione S-transferases (GSTs) constitute a complex and widespread superfamily classified as enzymes of secondary metabolism. However, despite the numerous associations of GSTs with stress responses, cell development and metabolism in various organisms, the functions of these enzymes remain usually evasive mainly due to their high diversity and also to the lack of knowledge about their catalytic specificities. In P. chrysosporium 27 GST isoforms have been highlighted and clustered into seven classes. Among them three are extended in saprophytic fungi: the Omega, the Ure2p and the etherase classes. Two members of the Omega class have been characterized at the biochemical level showing difference in substrate specificities. Indeed, PcGTO1 is member of a new class of Sglutathionyl- p-hydroquinone reductase, while PcGTO3 is rather active with phenylacetophenone. The three-dimensional structure of PcGTO1 confirms the hypothesis not only of a new biological class, but also of a new structural class that we propose to name GST xi. The second extended class we have studied is the Ure2p one. It is composed of nine isoforms in P. chrysosporium and clusters into two subclasses. Three Ure2p class members have been studied in more details at transcriptional, biochemical and physiological levels. PcUre2p4 and PcUre2p6 of the first subclass are specifically expressed in cultures treated with polycyclic aromatic hydrocarbons and the recombinant proteins are active as typical glutathione transferases. By contrast, PcUre2p1, which belongs to the second subclass is constitutively expressed whatever the condition tested and is active with small molecules as substrate, such as proteins from the Omega class. Physiological studies have revealed that these proteins do not have the same function than the Saccharomyce cerevisiae isoform, concerning both the response to oxidative stress and its involvement in the nitrogen catabolite repression. These results suggest that fungi, especially those with saprophytic capabilities, have developed specificities of GST function as an adaptation to environmental constraints