Manipulations microfluidiques de gouttelettes pour l'évolution dirigée des protéines

Droplet-based microfluidics for protein evolution

• Auteur / Autrice : Linas Mazutis
• Direction : Andrew D. Griffiths
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences
• Date : Soutenance en 2009
• Etablissement(s) : Strasbourg

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéines

Gouttes

Circuits intégrés

Microfluidique

Résumé

La compartimentalisation de la "soupe primordiale" dans des vésicules est considérée comme l'un des principaux facteurs ayant permis l'émergence de la vie. Ces gouttelettes de quelques micromètres créent un lien entre génotype et phénotype, et grâce à la division, un mécanisme pour l’hérédité et l’évolution, qui a conduit à l'émergence des cellules actuelles. De tels microcompartiments, peuvent être créés au laboratoire sous la forme d’une émulsion composée de millions de gouttelettes contenant des gènes et tous les ingrédients nécessaires pour leur expression in vitro. Ces émulsions miment ainsi des populations de cellules artificielles qui peuvent être sélectionnées pour un phénotype donné sous des conditions strictement contrôlées non réalisables dans des systèmes in vivo. Cette thèse de doctorat présente le développement de systèmes microfluidiques pour l’évolution dirigée. Les résultats obtenus montrent qu’il est possible de produire des gouttelettes hautement monodisperses pouvant être manipulées de manière précise et contrôlable, ce qui était jusqu’à présent impossible pour des émulsions réalisées par des méthodes classiques. En utilisant un ensemble de nouveaux dispositifs microfluidiques et une composition adéquate d’huile porteuse, des gènes uniques ont été amplifiés et leur expression in vitro mesurée en microgouttelettes. Ces dispositifs ont ensuite été utilisés pour réaliser et analyser des réactions biologiques complexes et multi-étapes. Une technique originale de fusion passive de paires de gouttelettes a également été développée. Ces travaux constituent les premiers pas vers la création de plate-formes microfluidiques intégrées et totalement in vitro.

The compartmentalization of the primordial soup into vesicles is thought to be one of the key features in the early emergence of life. These tiny micrometer-sized droplets provided a linkage between phenotype and genotype, and through division, a mechanism for heredity and evolution, which gave rise to modern cells. Man-made compartments, in the form of an emulsion, can also provide a tool of linking genotype to phenotype. Composed of millions of droplets containing genes with all ingredients necessary for in vitro expression, emulsions mimic populations of artificial cells that can be selected for a particular phenotype under strictly controlled conditions not feasible in living systems. The research described in this doctoral thesis focuses on the development of droplet-based microfluidics for protein evolution and presents the first steps toward an integrated and completely in vitro microfluidics platform. The results obtained in this work show that it is possible to produce highly monodisperse picoliter volume droplets (CV<1%) that can be manipulated in a precise and controllable manner, previously impossible in bulk emulsions. Using a set of novel microfluidic devices and an adequate composition of carrier oil single genes in droplets were amplified and their in vitro expression measured. The same microfluidic system was also used to perform multiple operations in order to analyze complex and sequential biological reactions in droplets. Moreover, a new passive droplet fusion technique has been developed, which can be used for preparation of monodisperse emulsions composed of pairwise fused droplets.